目的探讨核纤层蛋白B1(lamin B1,LMNB1)对肝癌进展的影响,发掘肝癌新的治疗靶点。方法利用工具网站基因表达水平值的交互式分析平台(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome...目的探讨核纤层蛋白B1(lamin B1,LMNB1)对肝癌进展的影响,发掘肝癌新的治疗靶点。方法利用工具网站基因表达水平值的交互式分析平台(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中肝癌组织及癌旁组织LMNB1的表达水平,使用Kaplan-Meier分析LMNB1表达水平差异对肝癌患者预后的影响。采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测正常肝细胞系及肝癌细胞系中LMNB1表达水平。选取LMNB1表达水平较高的两种人肝癌细胞株Hep3B、HepG2,转染小干扰RNA敲低LMNB1表达,在LMNB1表达水平较低的细胞SUN475中构建LMNB1稳定过表达细胞系并使用Western blot验证转染效率,采用CCK8法检测敲低或过表达LMNB1后肝癌细胞的增殖能力,采用平板克隆形成检测敲低或过表达LMNB1后细胞形成克隆的能力。采用Transwell检测敲低或过表达LMNB1后细胞侵袭及迁移能力的变化。采用Western blot实验检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK)及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的变化。结果TCGA数据库分析表明肝癌组织中LMNB1表达水平较癌旁正常组织高(P<0.05),且LMNB1表达水平与肝癌患者预后呈负相关(P=0.003)。实时定量PCR显示相对正常人肝细胞系,肝癌细胞中LMNB1 mRNA表达量分别为MHCC97H:1.80±0.10(t=11.08,P<0.001);SUN475:1.29±0.03(t=5.88,P=0.004);HepG2:2.97±0.04(t=39.68,P<0.001);PLC/Prf/5:1.74±0.04(t=14.51,P<0.001);HuH7:1.70±0.02(t=15.22,P<0.001);SK-HEP-1:1.59±0.05(t=11.17,P<0.001);Hep3B:2.27±0.09(t=18.50,P<0.001);均显著高于正常人肝细胞系。Westernblot结果显示在HepG2及Hep3B细胞系中,与siScramble阴性对照组相比,转染siLMNB1实验组的LMNB1表达水平显著降低(HepG2:0.60±0.10 vs 1.60±0.10,t=11.55,P<0.001;Hep3B:0.40±0.10 vs 1.70±0.10;t=15.61,P<0.001);而SUN475中转染质粒后LMNB1表达显著增加(0.70±0.20 vs 0.07±0.04;t=5.541,P=0.005)。敲低LMNB1后培养96 h,与对照组相比,Hep3B(10.81±0.67 vs 15.48±0.62;t=8.86,P<0.001)及HepG2(9.45±0.61 vs17.08±0.75;t=13.67,P<0.001)细胞增殖能力被显著抑制;而在SUN475中过表达LMNB1后,实验组细胞增殖活性显著增加(16.94±1.52 vs 12.65±1.06;t=3.99,P=0.016)。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,细胞克隆形成数显著减少[HepG2:(90.30±7.24)个vs(382.01±25.27)个,t=19.24,P<0.001;Hep3B:(128.03±8.24)个vs(395.85±28.27)个,t=15.76,P<0.001],在SUN475中过表达LMNB1组比对照组克隆形成个数显著增加[(467.82±42.45)个vs(85.31±15.32)个;t=14.87,P=0.001]。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,肝癌细胞迁移数量显著减少[HepG2:(75.25±8.10)个vs(15.02±3.50)个,t=11.90,P<0.001;Hep3B:(168.20±12.26)个vs(34.83±7.61)个,t=15.96,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著减少[HepG2:(110.21±12.01)个vs(25.76±4.03)个,t=11.50,P<0.001;Hep3B:(150.22±15.16)个vs(22.03±14.26)个,t=10.65,P<0.001];在SUN475中,过表达LMNB1组比对照组细胞迁移数量显著增加[(50.11±5.55)个vs(349.85±25.26)个;t=11.33,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著增加[(40.11±5.26)个vs(80.13±12.20)个;t=5.21,P=0.007]。与对照组相比,敲低LMNB1后,AKT的磷酸化活性形式p-AKT表达水平显著下降,而过表达LMNB1可导致p-AKT表达升高(P均<0.05)。而敲低或过表达LMNB1后,p-ERK表达水平无显著变化,AKT和ERK的本底表达水平均未发生明显变化。结论抑制LMNB1可通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活抑制肝癌的发生发展,可作为诊断肝癌的生物标记物和潜在的治疗靶点。展开更多
文摘目的探讨核纤层蛋白B1(lamin B1,LMNB1)对肝癌进展的影响,发掘肝癌新的治疗靶点。方法利用工具网站基因表达水平值的交互式分析平台(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中肝癌组织及癌旁组织LMNB1的表达水平,使用Kaplan-Meier分析LMNB1表达水平差异对肝癌患者预后的影响。采用实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测正常肝细胞系及肝癌细胞系中LMNB1表达水平。选取LMNB1表达水平较高的两种人肝癌细胞株Hep3B、HepG2,转染小干扰RNA敲低LMNB1表达,在LMNB1表达水平较低的细胞SUN475中构建LMNB1稳定过表达细胞系并使用Western blot验证转染效率,采用CCK8法检测敲低或过表达LMNB1后肝癌细胞的增殖能力,采用平板克隆形成检测敲低或过表达LMNB1后细胞形成克隆的能力。采用Transwell检测敲低或过表达LMNB1后细胞侵袭及迁移能力的变化。采用Western blot实验检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases,p-ERK)及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的变化。结果TCGA数据库分析表明肝癌组织中LMNB1表达水平较癌旁正常组织高(P<0.05),且LMNB1表达水平与肝癌患者预后呈负相关(P=0.003)。实时定量PCR显示相对正常人肝细胞系,肝癌细胞中LMNB1 mRNA表达量分别为MHCC97H:1.80±0.10(t=11.08,P<0.001);SUN475:1.29±0.03(t=5.88,P=0.004);HepG2:2.97±0.04(t=39.68,P<0.001);PLC/Prf/5:1.74±0.04(t=14.51,P<0.001);HuH7:1.70±0.02(t=15.22,P<0.001);SK-HEP-1:1.59±0.05(t=11.17,P<0.001);Hep3B:2.27±0.09(t=18.50,P<0.001);均显著高于正常人肝细胞系。Westernblot结果显示在HepG2及Hep3B细胞系中,与siScramble阴性对照组相比,转染siLMNB1实验组的LMNB1表达水平显著降低(HepG2:0.60±0.10 vs 1.60±0.10,t=11.55,P<0.001;Hep3B:0.40±0.10 vs 1.70±0.10;t=15.61,P<0.001);而SUN475中转染质粒后LMNB1表达显著增加(0.70±0.20 vs 0.07±0.04;t=5.541,P=0.005)。敲低LMNB1后培养96 h,与对照组相比,Hep3B(10.81±0.67 vs 15.48±0.62;t=8.86,P<0.001)及HepG2(9.45±0.61 vs17.08±0.75;t=13.67,P<0.001)细胞增殖能力被显著抑制;而在SUN475中过表达LMNB1后,实验组细胞增殖活性显著增加(16.94±1.52 vs 12.65±1.06;t=3.99,P=0.016)。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,细胞克隆形成数显著减少[HepG2:(90.30±7.24)个vs(382.01±25.27)个,t=19.24,P<0.001;Hep3B:(128.03±8.24)个vs(395.85±28.27)个,t=15.76,P<0.001],在SUN475中过表达LMNB1组比对照组克隆形成个数显著增加[(467.82±42.45)个vs(85.31±15.32)个;t=14.87,P=0.001]。在HepG2及Hep3B细胞系中敲低LMNB1后,肝癌细胞迁移数量显著减少[HepG2:(75.25±8.10)个vs(15.02±3.50)个,t=11.90,P<0.001;Hep3B:(168.20±12.26)个vs(34.83±7.61)个,t=15.96,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著减少[HepG2:(110.21±12.01)个vs(25.76±4.03)个,t=11.50,P<0.001;Hep3B:(150.22±15.16)个vs(22.03±14.26)个,t=10.65,P<0.001];在SUN475中,过表达LMNB1组比对照组细胞迁移数量显著增加[(50.11±5.55)个vs(349.85±25.26)个;t=11.33,P<0.001],侵袭的细胞数量同样显著增加[(40.11±5.26)个vs(80.13±12.20)个;t=5.21,P=0.007]。与对照组相比,敲低LMNB1后,AKT的磷酸化活性形式p-AKT表达水平显著下降,而过表达LMNB1可导致p-AKT表达升高(P均<0.05)。而敲低或过表达LMNB1后,p-ERK表达水平无显著变化,AKT和ERK的本底表达水平均未发生明显变化。结论抑制LMNB1可通过抑制PI3K/AKT信号转导通路的激活抑制肝癌的发生发展,可作为诊断肝癌的生物标记物和潜在的治疗靶点。
