临床血液学检验与内科血液专业结合进行教学的体会

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作者 黄宗干 刘国卿 《医学检验教育通讯》 1990年第6期3-3,共1页

关键词 血液学检验 内科血液专业 教学 医学教育

全文增补中

《临床血液学检验》课程的教学改革探讨 被引量：4

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作者 高娟 张伶 《国际检验医学杂志》 CAS 2008年第2期192-192,F0003,共2页

临床血液学检验作为检验医学的亚学科,也是医学检验学生的主干课程之一,提高其教学质量十分重要。优化教学内容以体现发展性;改革教学方式,充分利用多媒体实施以学生为主体的启发式、讨论式和研究式教学;培养学生的独立思考能力及创新精... 临床血液学检验作为检验医学的亚学科,也是医学检验学生的主干课程之一,提高其教学质量十分重要。优化教学内容以体现发展性;改革教学方式,充分利用多媒体实施以学生为主体的启发式、讨论式和研究式教学;培养学生的独立思考能力及创新精神,大胆开展科研性试验,以适应社会对新型复合型检验人才的需求。 展开更多

关键词 血液学试验 教育改革

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原发性血小板减少性紫癜患者血浆蛋白C活性变化及临床意义 被引量：1

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作者 刘国卿 黄宗干 《临床血液学杂志》 CAS 1996年第2期65-66,共2页

检测了４３例原发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患者血浆中蛋白Ｃ（ＰＣ）活性和５０例正常人ＰＣ活性，前者为７９．８±２３．４％；后者９４．４±１３．２％。ＩＴＰ患者血浆ＰＣ抗凝活性显著低于正常对照组（Ｐ＜０．０１... 检测了４３例原发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）患者血浆中蛋白Ｃ（ＰＣ）活性和５０例正常人ＰＣ活性，前者为７９．８±２３．４％；后者９４．４±１３．２％。ＩＴＰ患者血浆ＰＣ抗凝活性显著低于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。分析了ＩＴＰ患者的ＰＣ活性与血小板数量、功能，血小板表面相关ＩｇＧ（ＰＡＩｇＧ），血浆纤维结合蛋白（Ｆｎ）之间无相关关系。 展开更多

关键词 紫癜 原发性 血小板减少性 蛋白C

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高血压病、冠心病患者血浆中蛋白C、纤维结合蛋白以及有关因素的临床研究

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作者 梁晓玫 刘国卿 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 1993年第2期134-135,共2页

本文对高血压病、心肌硬化型冠心病、心绞痛型冠心病患者血浆蛋白C(PC)、纤维结合蛋白(Fn),以及血浆纤维蛋白原(Fg),纤维蛋白(原)降解产物(FDP)进行了检测。结果表明:高血压患者血浆PC活性与正常对照组没有显著差异,而Fn、FDP却显著性... 本文对高血压病、心肌硬化型冠心病、心绞痛型冠心病患者血浆蛋白C(PC)、纤维结合蛋白(Fn),以及血浆纤维蛋白原(Fg),纤维蛋白(原)降解产物(FDP)进行了检测。结果表明:高血压患者血浆PC活性与正常对照组没有显著差异,而Fn、FDP却显著性升高。高血压病组与心肌硬化型冠心病组、心绞痛型冠心病组比较,Fn极显著性升高,FDP也显著高于心绞痛型冠心病组。被检测的两型冠心病组患者血浆的PC活性、Fn含量均显著性高于正常对照组。三组中仅心绞痛型冠心病组Fg含量显著性高于正常对照组,而FDP含量又显著低于高血压病组。这对高血压。 展开更多

关键词 高血压 冠心病 纤维连接素 C蛋白

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Skp2反义寡核苷酸对K562细胞生长和增殖的影响 被引量：5

5

作者 王小中 冯文莉 +2 位作者 刘兴 曹唯希 黄宗干 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第9期948-953,共6页

背景与目的:泛素-蛋白酶体途径是真核细胞中选择性降解短寿命蛋白的重要途径。S期激酶相关蛋白2(S-phasekinase-associatedprotein2,Skp2)是此途径中的一个重要组件,它是决定细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27降解的关键蛋白。近年来,在... 背景与目的:泛素-蛋白酶体途径是真核细胞中选择性降解短寿命蛋白的重要途径。S期激酶相关蛋白2(S-phasekinase-associatedprotein2,Skp2)是此途径中的一个重要组件,它是决定细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27降解的关键蛋白。近年来,在实体瘤的研究中发现Skp2是癌蛋白,能促进癌细胞的细胞周期进展,但在白血病细胞恶性增殖中所起的作用还未见报道。本实验旨在研究Skp2反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)对白血病细胞系K562细胞生长和增殖的影响及其可能的机制。方法:Skp2反义寡核苷酸和K562细胞共同培养,通过显微镜下观察、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察K562细胞生长和增殖,流式细胞术分析细胞周期,逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和细胞免疫化学测定Skp2mRNA、蛋白及p27mRNA、蛋白的表达。结果:Skp2反义寡核苷酸处理后,K562细胞增殖受抑,细胞周期阻滞于G0/G1期犤Skp2ASODN组(39.7±9.1)%,对照组(31.5±7.3)%,P<0.05犦。Skp2mRNA及Skp2蛋白水平降低;尽管p27mRNA未见改变,但其蛋白水平明显升高。结论:Skp2反义寡核苷酸能抑制K562细胞增殖,这种抑制作用主要是通过调控泛素-蛋白酶体途径,进而影响细胞周期进展而实现的。 展开更多

关键词 SKP2 反义寡核苷酸 K562 细胞生长 细胞增殖 S期激酶相关蛋白2 细胞周期 慢性粒细胞白血病

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探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对32D-BCR／ABL细胞增殖的影响 被引量：5

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作者 王雅珍 曾建明 +7 位作者 袁颖 魏容 彭智 肖青 刘钉宾 黄世峰 陈新敏 冯文莉 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期518-522,共5页

目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达。本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖... 目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达。本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响及其可能的分子机制。方法:用电转染方法将hnRNP E2诱骗RNA野生序列和突变序列的表达载体(pGD和pGM)转入32D-BCR/ABL细胞,用G418筛选出稳定表达诱骗RNA的细胞。锥虫蓝染色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。FCM分析细胞周期,RT-PCR和Western印迹法检测下游CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-bindingproteinα,C/EBPα)和c-Myc的表达。结果:筛选出稳定表达野生型和突变型诱骗RNA的32DP210-pGD细胞和32DP210-pGM细胞。野生型32DP210-pGD细胞与未转染32D-BCR/ABL细胞相比,其细胞增殖抑制率为(69.48±5.21)%,克隆形成能力明显减弱,细胞周期由G0/G1期向S期进展受阻;C/EBPαmRNA水平无改变,但在蛋白水平上42 ku-C/EBPα的表达增加(43.83±4.91)%;c-Myc mRNA水平下降(35.67±6.64)%,蛋白水平降低(30.91±3.84)%。突变型32DP210-pGM细胞与未转染32D-BCR/ABL的细胞相比,其上述各指标无明显差异。结论:hnRNP E2诱骗RNA能够抑制32D-BCR/ABL细胞的增殖,其机制可能是诱骗RNA阻断hnRNP E2和C/EBPαmRNA的结合,引起42 ku-C/EBPα表达增加,进而引起其下游靶基因c-Myc下调。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 多聚嘧啶区结合蛋白质 CCAAT增强子结合蛋白α 细胞增殖 诱骗RNA

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PTD-OD-HA融合蛋白对bcr/abl阳性细胞凋亡的影响 被引量：4

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作者 黄峥兰 季茂胜 +5 位作者 袁颖 黄世峰 刘钉宾 曾建明 温健萍 冯文莉 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期267-271,共5页

目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响。方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细... 目的:研究含有蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)、寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)和HA标签的PTD-OD-HA融合蛋白对几种bcr/abl阳性细胞株细胞凋亡的影响。方法:将前期制备的PTD-OD-HA蛋白作用于几种bcr/abl阳性细胞后,应用FCM法、DNA梯度电泳(DNAladder)和透射电子显微镜检测细胞凋亡,RT-PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白水平变化。结果:FCM法检测发现,PTD-OD-HA能促进bcr/abl阳性细胞发生凋亡;DNA ladder实验检测发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210和K562细胞DNA电泳有梯状条带;透射电子显微镜观察发现,PTD-OD-HA作用后BaF3-P210细胞发生了凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测显示,促凋亡基因bax的mRNA及蛋白水平增高,抗凋亡基因bcl-2的mRNA及蛋白水平降低。结论:PTD-OD-HA蛋白可以特异性诱发bcr/abl阳性细胞的凋亡。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 重组融合蛋白质类 细胞凋亡 融合蛋白类 bcr-abl

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STAT5诱骗核苷酸对K562细胞中bcl-x启动子转录激活的调控 被引量：3

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作者 曾建明 冯文莉 +3 位作者 王小中 史梅 涂植光 黄宗干 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期414-418,共5页

背景与目的:信号转导和转录活化因子5(signaltransducersandactivatorsoftranscription5,STAT5)组成性激活在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)细胞恶性转化中起重要作用。本文研究STAT5诱骗核苷酸(decoyoligonucleotides,d... 背景与目的:信号转导和转录活化因子5(signaltransducersandactivatorsoftranscription5,STAT5)组成性激活在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)细胞恶性转化中起重要作用。本文研究STAT5诱骗核苷酸(decoyoligonucleotides,decoyODNs)对STAT5下游靶基因bcl鄄x转录激活的调控作用。方法:设计并合成decoyODNs、错配核苷酸(M鄄ODNs)和FAM标记decoyODNs。FAM鄄decoyODNs作为对照,在脂质体介导下转染白血病细胞K562,流式细胞仪(FCM)和倒置荧光显微镜检测FAM鄄decoyODNs的摄入情况。构建人bcl鄄x启动子的荧光素酶报告质粒pGL3b鄄bclxP,将其与decoyODNs或M鄄ODNs共转染K562细胞,检测转染后K562细胞中荧光素酶的表达。K562细胞分别转染decoyODNs和M鄄ODNs后,用RT鄄PCR检测bcl鄄xL表达,FCM检测细胞凋亡。结果:FAM鄄decoyODNs在终浓度0.04～4μmol/L范围内的摄入量呈剂量依赖性。24h时FAM鄄decoyODNs4μmol/L处理组转染效率高达99.1%,并在倒置荧光显微镜下也观察到细胞内有绿色荧光物质。decoyODNs处理组荧光素酶活性降低[(181.48±204.46)RLU/μgprotein],与对照组[(675.26±62.91)RLU/μgprotein]相比有显著性差异(P<0.05);而M鄄ODNs处理组细胞荧光素酶的活性[(632.07±98.95)RLU/μgprotein]与对照? 展开更多

关键词 慢性粒细胞白血病 STAT5 转录因子 转录调控 诱骗核苷酸

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STAT 5诱杀寡脱氧核苷酸对K 562细胞裸鼠致瘤能力的影响 被引量：3

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作者 王小中 冯文莉 +6 位作者 曾建明 史梅 白卫君 赵世巧 曹唯希 涂植光 黄宗干 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期935-938,共4页

目的:通过动物实验,研究裸鼠信号转导及转录活化蛋白5(signal transducer and activator of transcription5,STAT5)诱杀寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,Decoy ODN)的抑瘤作用。方法:采用皮下注射的方法建立K562细胞裸鼠移植... 目的:通过动物实验,研究裸鼠信号转导及转录活化蛋白5(signal transducer and activator of transcription5,STAT5)诱杀寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,Decoy ODN)的抑瘤作用。方法:采用皮下注射的方法建立K562细胞裸鼠移植瘤模型,瘤体内注射脂质体-ODN混合物,观察裸鼠生长状况、瘤体大小等。分别采用反转录-聚合酶链反应(reverse tran-scription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western印迹法检测瘤组织中bcl-xL、cyclin D1和c-myc的mRNA和蛋白表达水平的改变情况。结果:经Decoy ODN处理抑制了K562细胞对裸鼠的致瘤能力,瘤体积和质量明显小于突变ODN组[MutantODN组瘤重(0.93±0.22)gvsDecoy ODN组瘤重(0.485±0.178)g,P<0.05],肿瘤生长抑制率达47.7%。RT-PCR、Western印迹检测结果显示bcl-xL、cyclin D1和c-myc的mRNA和蛋白表达水平下调。结论:转录因子诱杀策略可以有效地在移植瘤裸鼠模型体内阻断STAT5靶基因的表达。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 STAT5转录因子 诱杀寡脱氧核苷酸 结合 竞争性 小鼠 裸

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重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响 被引量：3

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作者 史静 胡晶 +5 位作者 肖青 彭智 曹唯希 罗秋平 王方 冯文莉 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1806-1811,共6页

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pm... 目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。 展开更多

关键词 Bcr-Ab1 SH2 DED 重组腺病毒 AD293细胞

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β-TrCP-OD-HA重组腺病毒对白血病K562细胞凋亡的影响 被引量：3

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作者 罗红伟 田文君 +4 位作者 季茂胜 刘钉宾 王小飞 黄宗干 冯文莉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期1602-1604,共3页

目的研究癌蛋白Bcr-Abl被泛素-蛋白酶体系统靶向降解的可能性及诱导白血病K562细胞凋亡的作用。方法含有Bcr-Abl融合蛋白N端寡聚化区(OD)的重组腺病毒Ad5β-TrCP-OD-HA特异性结合Bcr-Abl融合蛋白的N端寡聚化区(OD),通过感染将嵌合泛素... 目的研究癌蛋白Bcr-Abl被泛素-蛋白酶体系统靶向降解的可能性及诱导白血病K562细胞凋亡的作用。方法含有Bcr-Abl融合蛋白N端寡聚化区(OD)的重组腺病毒Ad5β-TrCP-OD-HA特异性结合Bcr-Abl融合蛋白的N端寡聚化区(OD),通过感染将嵌合泛素连接酶β-TrCP运送到靶细胞K562细胞,同时,β-TrCP基因突变的重组腺病毒Ad5△F-TrCP-OD-HA和仅含绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒Ad5GFP,分别作为对照。感染后,Western blot检测Bcr-Abl融合蛋白的表达;倒置显微镜、光镜和电镜观察细胞形态学变化。结果成功建立携β-TrCP-OD-HA、△F-TrCP-OD-HA的重组腺病毒的K562细胞株,重组腺病毒感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组的Bcr-Abl融合蛋白含量下降,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);倒置显微镜可见Ad5β-TrCP-OD-HA作用后细胞体积变小、形态不规则;光镜下发现胞体变小,细胞质空泡,细胞核出现碎裂和凋亡小体;电镜观察到出现了典型的细胞凋亡的超微结构。结论重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA在白血病K562细胞内能够降低Bcr-Abl融合蛋白含量,并且诱导K562细胞发生了凋亡。 展开更多

关键词 Bcr—Abl融合蛋白 泛素连接酶 β-TrCP K562细胞 细胞凋亡

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泛素连接酶β-TrCP降角翠BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制 被引量：3

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作者 田文君 罗红伟 +4 位作者 袁颖 黄世峰 刘钉宾 陶昆 冯文莉 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期66-70,共5页

目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌... 目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响。方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5ΔF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒载体,感染K562细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA能够在白血病K562细胞中表达;β-TrCp-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。 展开更多

关键词 BCR—ABL融合蛋白 泛素连接酶β—TrCP K562细胞细胞增殖

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GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL-12真核双表达质粒的构建及表达 被引量：3

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作者 陶崑 王东 +5 位作者 曾建明 黄世峰 陈新敏 曹唯希 黄宗干 冯文莉 《第四军医大学学报》 北大核心 2008年第4期361-365,共5页

目的:构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL-12(mIL-12)真核双表达质粒,在COS-7细胞中检测其基因和膜蛋白表达.方法:以含有慢粒白血病(b3a2型)migP210全长序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得654bp的bcr/abl融合基因片段,... 目的:构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL-12(mIL-12)真核双表达质粒,在COS-7细胞中检测其基因和膜蛋白表达.方法:以含有慢粒白血病(b3a2型)migP210全长序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得654bp的bcr/abl融合基因片段,酶切后插入pBudCE4.1空载中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时,RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI锚定序列,酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因片断羧基端相连,获得重组质粒pBBG并鉴定.然后扩增mIL-12基因片段并亚克隆入pBBG另一多克隆位点,构建重组质粒pBBGI.在多聚阳离子介导下将pBBGI质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR,Western Blot检测bcr/abl融合基因及其蛋白的表达,ELISA检测mIL-12的表达.结果:经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL-12基因插入片段正确;转染细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达,细胞培养上清中也有mIL-12的表达.结论:成功构建能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL-12的重组质粒PBBGI,为进一步研究bcr/abl基因疫苗诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础. 展开更多

关键词 BCR/ABL融合基因 糖基磷脂酰肌醇类 白细胞介素-12 真核双表达

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靶向激活蛋白激酶PKR诱导白血病K562细胞凋亡 被引量：2

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作者 白卫君 王小中 +6 位作者 曾建明 赵世巧 温健萍 肖青 曹唯希 黄宗干 冯文莉 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期35-41,共7页

目的:采用双链RNA能激活细胞内蛋白激酶PKR引起细胞凋亡的策略,研究重组慢性粒细胞白血病独特的bcr/ablb3a2型外源反义RNA诱导白血病K562细胞的凋亡及其作用机制。方法:用含bcr/abl融合基因序列40bp的反转录病毒载体RV-40AS作用于白血病... 目的:采用双链RNA能激活细胞内蛋白激酶PKR引起细胞凋亡的策略,研究重组慢性粒细胞白血病独特的bcr/ablb3a2型外源反义RNA诱导白血病K562细胞的凋亡及其作用机制。方法:用含bcr/abl融合基因序列40bp的反转录病毒载体RV-40AS作用于白血病K562细胞,以光学显微镜、电子显微镜、FCM法和DNA梯状条带法检测细胞凋亡情况,化学比色法检测caspase-8和caspase-9活性变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2 mRNA表达变化,并以Western印迹法检测双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)、磷酸化PKR(p-PKR)、Bax和Bcl-2的蛋白变化。结果:RV-40AS作用K562细胞组在光学显微镜下出现胞体皱缩、染色质浓集以及折光性减弱,电子显微镜下可见细胞质电子密度增大、核固缩和出现凋亡小体;FCM法检测到凋亡细胞占(22.70±1.42)%[未处理组(3.24±0.66)%],DNA电泳出现典型的梯状条带;caspase-8和caspase-9活性升高,PKR蛋白无明显变化,但p-PKR水平升高;Bax的mRNA和蛋白表达均升高,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平没有明显变化。对照组和PKR抑制剂处理组均未发生上述改变。结论:bcr/abl反义RNA反转录病毒载体RV-40AS可特异性激活PKR,从而诱导白血病K562细胞发生凋亡,其可能的机制是PKR活化激活了凋亡反应的上游分子caspase-8,并通过上调Bax表达水平、降低Bcl-2/Bax的比值,导致线粒体膜稳定性被破坏,促使凋亡小体形成和caspase-9活化,最终激活其他凋亡分子使细胞发生凋亡。 展开更多

关键词 白血病 蛋白激酶类 细胞凋亡 K562细胞

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PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞增殖的影响 被引量：2

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作者 黄峥兰 季茂胜 +5 位作者 袁颖 黄世峰 刘钉宾 曾建明 温健萍 冯文莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期849-852,856,共5页

目的研究PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞株增殖的影响。方法将前期制备的PTD-OD-HA融合蛋白作用于两种BCR-ABL阳性细胞株BaF3-P210和K562,同时设立PBS和OD-HA融合蛋白对照组,用MTT法检测细胞的生长情况。48h后离心收集细胞,用瑞氏... 目的研究PTD-OD-HA融合蛋白对BCR-ABL阳性细胞株增殖的影响。方法将前期制备的PTD-OD-HA融合蛋白作用于两种BCR-ABL阳性细胞株BaF3-P210和K562,同时设立PBS和OD-HA融合蛋白对照组,用MTT法检测细胞的生长情况。48h后离心收集细胞,用瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态改变,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化,RT-PCR、Westernblot-ting检测c-myc、cyclinD1mRNA及蛋白表达的变化。结果 MTT检测发现,与PBS和OD-HA对照组比较,PTD-OD-HA能抑制BCR-ABL阳性细胞株的生长。瑞氏染色及透射电镜观察见PTD-OD-HA处理的细胞胞质内有大量空泡样变,出现大量的溶酶体,线粒体广泛扩张;FCM检测发现G1期细胞比例增加,S期和G2期细胞比例减少;RT-PCR及Westernblotting检测发现c-myc、cyclinD1的mRNA及蛋白水平均降低。结论 PTD-OD-HA融合蛋白可抑制BCR-ABL阳性细胞生长,使细胞形态发生改变,并使细胞阻滞在G1期,这些改变可能是通过下调c-myc、cyclinD1的表达实现的。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 融合蛋白质类 bcr-abl 细胞增殖

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cDNA芯片检测STAT5诱骗核苷酸对K562细胞凋亡相关基因的影响 被引量：1

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作者 曾建明 冯文莉 +3 位作者 王小中 史梅 涂植光 黄宗干 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期738-742,共5页

目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提... 目的：转录因子STAT5在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)中组成性激活,并与CML细胞恶性表型密切相关,本研究用cDNA芯片检测方法探讨诱骗核苷酸(decoy ODNs)抑制STAT5对白血病K562细胞株凋亡相关基因的影响。方法：分别提取decoy ODNs处理前后的K562细胞总RNA,逆转录合成Cy3、Cy5标记的cDNA探针,与人14K基因表达谱cDNA芯片(V2.0)杂交,扫描获得数据后,用Genespring软件分析对照组和实验组的差异表达基因,半定量RT- PCR验证cDNA芯片结果。结果：2张cDNA芯片检测重复性良好(R=0.9799)。在13824个标记的基因中,检出413个上调基因,其中包括：TIAF1、GAB1、GYPA、DAPK3、TNFRSF1B、IRF1和PML等在内的18个凋亡相关基因；在检出的332个下调基因中,发现PIM1、CCND2、CCND1、MYC和BCL2L1等在内的11个凋亡相关基因；部分基因经半定量RT-PCR证实与cDNA芯片结果一致。结论：Decoy ODNs抑制STAT5信号通路后可引起K562细胞多种凋亡相关基因的变化,本实验为进一步研究STAT5信号通路所调控的凋亡相关基因提供了依据。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 信号转导和转录活化因子 诱骗脱氧寡核苷酸 细胞凋亡 寡核苷类排列序列分析 K562细胞

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顺铂对bcr/abl转化BaF3-P210细胞DNA损伤与修复能力的影响 被引量：1

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作者 朱喜丹 史梦 +4 位作者 袁颖 曾建明 黄世峰 陶崑 冯文莉 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期731-735,共5页

目的:研究顺铂(cisplatin,Cis)对白血病BaF3-MIGR1细胞和bcr/abl转化BaF3-P210细胞中DNA损伤修复能力的影响。方法:锥虫蓝染色法检测2种细胞经0.5、1、5、10、20和40μg/mL Cis处理0、2、4、6、8、12、24和48 h时的存活率,免疫荧光法检... 目的:研究顺铂(cisplatin,Cis)对白血病BaF3-MIGR1细胞和bcr/abl转化BaF3-P210细胞中DNA损伤修复能力的影响。方法:锥虫蓝染色法检测2种细胞经0.5、1、5、10、20和40μg/mL Cis处理0、2、4、6、8、12、24和48 h时的存活率,免疫荧光法检测上述6种浓度Cis处理细胞8 h后诱导的γH2AX焦点数,Western印迹法检测DNA修复0、4、12和24 h后的γH2AX蛋白表达情况。结果:随着Cis处理时间和剂量增加,2种细胞的存活率降低,BaF3-P210转化细胞的存活率比BaF3-MIGR1细胞高(P<0.05);随着Cis剂量上升,2种细胞的γH2AX焦点数上升,BaF3-P210转化细胞的焦点数比BaF3-MIGR1细胞少(P<0.05);随着DNA修复时间延长,2种细胞的γH2AX蛋白表达均下调,BaF3-P210转化细胞的γH2AX蛋白表达量比BaF3-MIGR1细胞低。结论:Cis对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210转化细胞的损伤呈时间、剂量效应,2种细胞的γH2AX焦点数与损伤之间存在剂量效应,bcr/abl可增强BaF3-P210转化细胞的DNA修复能力。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 顺铂 γH2AX蛋白质 DNA损伤 DNA修复 融合蛋白质类 bcr-abl

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bcr-abl反转录病毒介导的慢性粒细胞白血病样小鼠二次移植模型的建立 被引量：1

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作者 张文萍 黄世峰 +5 位作者 袁颖 王雅珍 温健萍 曹唯希 黄宗干 冯文莉 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期508-513,共6页

目的:构建bcr-abl反转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)样二次移植模型,为深入研究CML的发病和治疗机制奠定可靠的基础。方法:收集已成功建模的由bcr-abl反转录病毒介导的CML样模型小鼠的骨髓细胞或脾细... 目的:构建bcr-abl反转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)样二次移植模型,为深入研究CML的发病和治疗机制奠定可靠的基础。方法:收集已成功建模的由bcr-abl反转录病毒介导的CML样模型小鼠的骨髓细胞或脾细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量γ射线(450 cGy)照射的同种雌性受体鼠,进行造血组织的形态学观察、Y染色体及其特异性性别决定基因Sry的检测以及bcr-abl mRNA和蛋白水平表达的检测,分析鉴定CML样小鼠二次移植模型情况。结果:移植后12 d,肉眼可见明显的脾结节形成,连续切片可见成堆脾集落。移植4~5周后,在雌性受体小鼠骨髓中检出相似Y染色体及Y染色体特异性Sry基因,骨髓和脾脏中检出bcr-abl融合基因。移植10~12周后外周血白细胞水平升高至正常未处理小鼠的4~8倍,粒系细胞水平明显升高至(20~32)×109个/L,外周血涂片幼稚细胞占10%~20%;骨髓涂片结果显示粒系细胞显著增多,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;同时,在肝脏中检测出bcr-abl融合基因,骨髓中检测出bcr-abl融合蛋白的表达。移植18周后,外周血涂片幼稚细胞占30%以上,小鼠发生急性变,最终因肺出血相继死亡。结论:本研究成功建立了bcr-abl反转录病毒介导的小鼠CML样二次移植模型,该模型可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究。 展开更多

关键词 白血病 髓样 慢性 融合蛋白质类 bcr—abl 异种移植模型抗肿瘤试验 小鼠 近交BALB/C

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重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响 被引量：1

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作者 曾建明 冯文莉 +6 位作者 王小中 赵世巧 白卫君 罗云萍 温健萍 涂植光 黄宗干 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第21期2130-2134,共5页

目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同... 目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Westernblot检测PKR激活情况。结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P<0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用。结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略。 展开更多

关键词 慢性粒细胞白血病 PKR 反义RNA 逆转录病毒载体 基因克隆

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HA-2FKBP-ABD融合蛋白的原核表达及与BCR-ABL的相互作用 被引量：1

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作者 高淼 黄峥兰 +3 位作者 李千音 李会 钟梁 冯文莉 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期268-271,共4页

目的构建经原核表达和纯化的HA-2FKBP-ABD(HF2A)融合蛋白,探讨HF2A对BCR-ABL的靶向作用。方法用PCR扩增HF2A片段,将HF2A克隆入pET32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化HF2A蛋白,SDS-PAGE分析诱导和纯化的条件,western ... 目的构建经原核表达和纯化的HA-2FKBP-ABD(HF2A)融合蛋白,探讨HF2A对BCR-ABL的靶向作用。方法用PCR扩增HF2A片段,将HF2A克隆入pET32a(+)原核表达载体,IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化HF2A蛋白,SDS-PAGE分析诱导和纯化的条件,western blot鉴定HF2A蛋白的表达,pull down实验检测HF2A与BCR-ABL的相互作用。结果重组原核表达载体经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;0.1 mmol/L IPTG 25℃诱导4 h获得HF2A蛋白的高表达,其分子量(Mr)约为74 000,纯化后可获得高纯度的HF2A蛋白;HF2A与BCR-ABL能相互作用。结论成功表达并纯化了HF2A融合蛋白,HF2A能够靶向作用BCR-ABL。 展开更多

关键词 原核表达 蛋白质纯化 BCR-ABL 慢性粒细胞白血病 ABL结合结构域

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