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反向DNA-pull down方法的建立
1
作者 褚佳琪 王雪茗 +1 位作者 寇艳波 颜晓庆 《交通医学》 2024年第6期561-565,共5页
目的:建立反向DNA-pull down方法,验证目的蛋白与靶DNA的结合,为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段。方法:以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板,通过PCR扩增获得转录因子PU.1-ETS结构域编码序列,通过酶切连接的方式连入表达质粒pE... 目的:建立反向DNA-pull down方法,验证目的蛋白与靶DNA的结合,为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段。方法:以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板,通过PCR扩增获得转录因子PU.1-ETS结构域编码序列,通过酶切连接的方式连入表达质粒pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导蛋白异源表达。以小鼠基因组DNA为模板,通过PCR获得Ly96启动子序列。将异源表达的PU.1 ETS结合至Ni-NTA磁珠后,与靶DNA—Ly96启动子体外孵育,最终经蛋白酶K酶解、DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS体外结合Ly96启动子情况,评估反向DNA-pull down技术的可行性。结果:通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS复合物,通过PCR获得Ly96启动子序列,经反向DNA-pull down验证PU.1 ETS与Ly96启动子的相互结合作用。结论:以PU.1-ETS-Ly96启动子相互作用为例,证实反向DNA pull-down技术的可行性,为探究已知蛋白与靶DNA结合和疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案。 展开更多
关键词 蛋白-DNA结合 反向DNA-pull down方法 异源表达 PU.1转录因子
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GPR30激活后下调P53-PUMA信号抑制全脑缺血诱导的海马神经元线粒体凋亡途径 被引量：5
2
作者 郭思含 孙立萍 +3 位作者 赵雨逢 韩东 王瑞敏 胡书群 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2021年第6期568-574,共7页
目的采用GPR30特异激动剂、拮抗剂作为工具药,已证实GPR30激活具有抗神经炎症和抗凋亡作用。但具体机制尚不清楚。文章旨在研究揭示G蛋白耦联雌激素受体30(GPR30)激活对脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的作用并进一步阐明其对P53-PUMA信号... 目的采用GPR30特异激动剂、拮抗剂作为工具药,已证实GPR30激活具有抗神经炎症和抗凋亡作用。但具体机制尚不清楚。文章旨在研究揭示G蛋白耦联雌激素受体30(GPR30)激活对脑缺血后海马CA1区神经元凋亡的作用并进一步阐明其对P53-PUMA信号的影响。方法采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,选择性诱导海马CA1区神经元延迟性死亡。雌性SD大鼠随机分为:假手术(Sham)组,缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)1d、3d、7d组,GPR30特异激动剂G1处理组(I/R 1d+G1,I/R 3d+G1),P53特异抑制剂Pifithrin-α(Pifi-α)处理组(Pifi-α,I/R 3d+Pifi-α,I/R 7d+Pifi-α),GPR30特异拮抗剂G36处理组(I/R 7d+Pifi-α+G36)。于大鼠切除双侧卵巢同时皮下埋置G1或G36微量释放泵,至实验结束;缺血前侧脑室注射P53抑制剂Pifi-α。Western Blot、免疫组化检测蛋白水平;TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡、NeuN染色观察神经元生存情况。结果激光扫描共聚焦显微镜下观察结果显示,I/R 7d组海马CA1区NeuN阳性染色细胞数量(7.500±2.320)较假手术组(61.000±2.671)减少(P<0.01),但TUNEL阳性细胞数量(73.667±5.296)增多较假手术组(3.667±1.174),差异有统计学意义(P<0.01)。与I/R 7d组相比,Pifi-α处理组海马CA1区NeuN阳性细胞数(58.143±4.783)增加(P<0.01),而TUNEL阳性细胞数(23.571±3.545)减少(P<0.01)。与I/R 7d+Pifi-α组相比,I/R 7d+Pifi-α+G36组NeuN阳性细胞数量(46.143±4.426)减少(P<0.01),而TUNEL阳性细胞数(46.143±3.985)增加(P<0.01)。Western blot结果显示,与假手术组相比,GCI后1d、3d海马CA1区P53磷酸化水平均升高(P<0.05)。与缺血/再灌注相应时间点相比,用G1激活GPR30受体降低了缺血/再灌注诱导的P53磷酸化水平(P<0.01)。免疫组化结果显示,与假手术组相比,缺血再灌注3d组海马CA1区p-P53免疫荧光强度增强,且与DAPI荧光共定位;而G1处理组类似于假手术组,显示海马CA1区p-P53免疫荧光强度较I/R 3d组降低。Western blot分析结果显示,与假手术组相比较,I/R 3d组海马CA1区PUMA水平明显升高,Bcl2水平降低(P<0.01);与I/R 3d组比较,I/R 3d+Pifi-α组PUMA蛋白降低(P<0.01),而Bcl2水平升高(P<0.01)。结论激活GPR30具有显著的神经保护作用,其作用机制与下调P53-PUMA信号通路、抑制线粒体凋亡密切相关。 展开更多
关键词 G蛋白耦联雌激素受体30 P53 P53上调凋亡调节因子 全脑缺血 凋亡
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miRNA-1246通过NF-κB介导乳腺癌细胞紫杉醇耐药的机制研究 被引量：2
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作者 王新 左文 +2 位作者 胡书群 周艳丽 韩娇 《实用药物与临床》 CAS 2023年第1期1-5,共5页
目的探讨微小RNA-1246(miR-1246)在乳腺癌细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用及相关机制。方法以SK-BR-3细胞构建PTX耐药乳腺癌细胞SK-BR-3/PTX作为SK-BR-3/PTX组,以正常SK-BR-3细胞作为SK-BR-3组;CCK-8实验检测两组细胞活力并计算凋亡指数;RT... 目的探讨微小RNA-1246(miR-1246)在乳腺癌细胞紫杉醇(PTX)耐药中的作用及相关机制。方法以SK-BR-3细胞构建PTX耐药乳腺癌细胞SK-BR-3/PTX作为SK-BR-3/PTX组,以正常SK-BR-3细胞作为SK-BR-3组;CCK-8实验检测两组细胞活力并计算凋亡指数;RTFQ-PCR检测miR-1246表达水平;免疫荧光实验和Western blot法检测P-gp蛋白表达。SK-BR-3/PTX细胞转染miR-1246 inhibitor和阴性对照(NC)inhibitor,分别设为miR-1246 inhibitor组和NC inhibitor组;Western blot法检测p-NF-κB p65、IκBα和P-gp蛋白表达。PTX处理miR-1246 inhibitor组和NC inhibitor组,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建PTX耐药乳腺癌细胞SK-BR-3/PTX,耐药指数为51.3。与SK-BR-3细胞相比,SK-BR-3/PTX细胞miR-1246表达水平显著升高(P<0.01),P-gp和p-NF-κB p65蛋白显著上调,IκBα蛋白明显下调(P<0.01),细胞核中NF-κB p65蛋白显著上调(P<0.01)。转染miR-1246 inhibitor可逆转SK-BR-3/PTX细胞上述蛋白表达变化(P<0.01)。miR-1246 inhibitor还可显著增强PTX诱导的SK-BR-3/PTX细胞凋亡(P<0.01)。结论miR-1246可能通过NF-κB信号通路诱导P-gp蛋白表达上调,从而诱导乳腺癌SK-BR-3细胞PTX耐药。 展开更多
关键词 微小RNA-1246 乳腺癌 紫杉醇 核因子ΚB P-糖蛋白
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基于Nomogram图预测甲状腺术后低钙血症的模型建立及临床价值 被引量：2
4
作者 丁伟 吕帝 +1 位作者 刘小华 胡书群 《中国现代普通外科进展》 CAS 2023年第7期531-536,共6页
目的:基于Nomogram图建立预测甲状腺术后发生低钙血症的模型,并探究该模型的临床价值。方法:纳入徐州医科大学附属医院2020年11月—2021年11月收治的247例甲状腺手术患者,按照其术后低钙血症发生情况,将患者分别纳入发生组、未发生组。... 目的:基于Nomogram图建立预测甲状腺术后发生低钙血症的模型,并探究该模型的临床价值。方法:纳入徐州医科大学附属医院2020年11月—2021年11月收治的247例甲状腺手术患者,按照其术后低钙血症发生情况,将患者分别纳入发生组、未发生组。运用单因素和多因素Logistic回归模型,分析影响患者发生低钙血症的相关因素。以独立危险因素构建二元Logistic回归并建立Nomogram图预测模型,并纳入74例甲状腺手术患者,验证模型的效能。结果:247例患者中,共有82例(33.20%)发生低钙血症。多因素Logistic回归模型示,女性、手术时间≥100 min、甲状旁腺腺体损伤均为影响甲状腺术后发生低钙血症的独立危险因素,单侧腺叶加峡部加对侧部分切除为保护性因素(P<0.05)。将基于独立危险因素建立的Nomogram图应用于训练集行内部验证,AUC为0.869(95%CI:0.820~0.918);验证集外部验证结果显示,AUC为0.876(95%CI:0.796~0.956),校正曲线均接近理想曲线,预测概率与实测值基本一致。结论:甲状腺术后患者低钙血症发生风险较高,且性别、手术时间、甲状旁腺腺体损伤情况、切除范围均与低钙血症的发生有关,结合上述因素构建的Nomogram图模型的预测准确性良好,能够为低钙血症的防治提供客观参考。 展开更多
关键词 Nomogram图 甲状腺手术 低钙血症 预测模型
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甲状腺乳头状癌中央区淋巴结转移的影响因素及预测模型建立
5
作者 丁伟 刘小华 +1 位作者 吕帝 胡书群 《中国现代普通外科进展》 CAS 2023年第11期864-868,共5页
目的:分析甲状腺乳头状癌(PTC)中央区淋巴结转移(CLNM)患者转移的相关因素,并建立CLNM可视化预测模型。方法:选取272例PTC患者(训练集),按照术后病理结果所示CLNM转移情况将其分为转移组和未转移组,对比两组临床资料、影像特征。通过多... 目的:分析甲状腺乳头状癌(PTC)中央区淋巴结转移(CLNM)患者转移的相关因素,并建立CLNM可视化预测模型。方法:选取272例PTC患者(训练集),按照术后病理结果所示CLNM转移情况将其分为转移组和未转移组,对比两组临床资料、影像特征。通过多因素Logistic回归模型分析影响PTC发生CLNM的相关因素,并使用Nomogram建立可视化预测模型。另选取81例PTC患者(验证集)验证模型效能。结果:训练集272例PTC患者中,54例(19.85%)经病理组织学检查明确存在CLNM。Logistic多因素分析示,合并微钙化、血流分级、不均匀强化、囊性变均为PTC发生CLNM的独立危险因素(P<0.05),而年龄越大是保护因素(P<0.05)。外部验证集验证结果显示,AUC为0.905。决策曲线分析结果表明该模型具有较大的临床应用价值。结论:PTC患者发生CLNM的影响因素众多,基于年龄等多项临床资料和影像学检查结果建立的预测模型能够准确预测患者CLNM发生情况。 展开更多
关键词 甲状腺乳头状癌 中央区淋巴结转移 影响因素 预测模型
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