目的:研究髓母细胞瘤患者中发现的Supressor of Fused(Sufu)的突变位点与Sonic Hedgehog(Shh)信号通路异常激活之间的联系,从而揭示其与肿瘤生长发展之间的关系。方法:构建Sufu突变位点的表达质粒,通过定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测Suf...目的:研究髓母细胞瘤患者中发现的Supressor of Fused(Sufu)的突变位点与Sonic Hedgehog(Shh)信号通路异常激活之间的联系,从而揭示其与肿瘤生长发展之间的关系。方法:构建Sufu突变位点的表达质粒,通过定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测Sufu突变体对Sufu^(-/-)细胞内源性Gli1表达水平的影响;通过免疫共沉淀检测Sufu突变体蛋白与Gli1的结合情况;通过MTT实验检测Sufu突变体对人髓母细胞瘤细胞(DAOY)生长增殖的影响。结果:定量PCR和蛋白免疫印迹实验发现,过表达Sufu的错义突变体(突变位点H87R)的Sufu^(-/-)细胞中内源性Gli1表达水平接近于过表达野生型Sufu的Sufu^(-/-)细胞,而过表达3个截短突变体(突变位点R146X、R299X、W430X)Sufu^(-/-)细胞中内源性Gli1表达水平相比于野生型明显增高。正常情况下野生型Sufu可以和Gli1蛋白结合,免疫共沉淀实验发现Sufu的突变体都不同程度地破坏了与Gli1蛋白的结合;蛋白周转速率实验发现Sufu的突变体可以通过蛋白酶体途径降解;MTT实验发现Sufu突变体失去了抑制DAOY细胞生长增殖的能力。结论:髓母细胞瘤患者身上观测到的Sufu突变位点可以驱动肿瘤的形成和生长,并通过细胞功能实验证实了Sufu通过结合Gli蛋白从而抑制其功能。展开更多
文摘目的:研究髓母细胞瘤患者中发现的Supressor of Fused(Sufu)的突变位点与Sonic Hedgehog(Shh)信号通路异常激活之间的联系,从而揭示其与肿瘤生长发展之间的关系。方法:构建Sufu突变位点的表达质粒,通过定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测Sufu突变体对Sufu^(-/-)细胞内源性Gli1表达水平的影响;通过免疫共沉淀检测Sufu突变体蛋白与Gli1的结合情况;通过MTT实验检测Sufu突变体对人髓母细胞瘤细胞(DAOY)生长增殖的影响。结果:定量PCR和蛋白免疫印迹实验发现,过表达Sufu的错义突变体(突变位点H87R)的Sufu^(-/-)细胞中内源性Gli1表达水平接近于过表达野生型Sufu的Sufu^(-/-)细胞,而过表达3个截短突变体(突变位点R146X、R299X、W430X)Sufu^(-/-)细胞中内源性Gli1表达水平相比于野生型明显增高。正常情况下野生型Sufu可以和Gli1蛋白结合,免疫共沉淀实验发现Sufu的突变体都不同程度地破坏了与Gli1蛋白的结合;蛋白周转速率实验发现Sufu的突变体可以通过蛋白酶体途径降解;MTT实验发现Sufu突变体失去了抑制DAOY细胞生长增殖的能力。结论:髓母细胞瘤患者身上观测到的Sufu突变位点可以驱动肿瘤的形成和生长,并通过细胞功能实验证实了Sufu通过结合Gli蛋白从而抑制其功能。
