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POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用
1
作者 王琳 袁建林 +3 位作者 缪昌 马玉晗 曹三杰 赵勤 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第2期272-283,共12页
为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRIS... 为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR基因,得到LO2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株。对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,LO2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);LO2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);LO2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株,并以AFB_(1)染毒处理分别研究了各细胞株的存活率和细胞形态学变化,发现POR基因对AFB_(1)所致细胞毒性的影响巨大。研究结果为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 POR CRISPR/Cas9 LO2细胞 AFB_(1)
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四川地区猪源艰难梭菌分子分型调查 被引量：1
2
作者 梁伟 王博 +4 位作者 赵勤 全柯吉 武耀民 缪昌 曹三杰 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期3726-3735,共10页
【背景】艰难梭菌是一种重要的人畜共患肠道病原菌,可引起人和多种动物抗生素相关性腹泻或假膜性肠炎。四川作为我国主要的生猪产区,还未有猪源艰难梭菌流行病学调查的相关报道,对猪源艰难梭菌的防控及保障猪肉安全带来挑战。【目的】... 【背景】艰难梭菌是一种重要的人畜共患肠道病原菌,可引起人和多种动物抗生素相关性腹泻或假膜性肠炎。四川作为我国主要的生猪产区,还未有猪源艰难梭菌流行病学调查的相关报道,对猪源艰难梭菌的防控及保障猪肉安全带来挑战。【目的】调查四川地区猪源艰难梭菌的感染、流行情况,并对分离出的艰难梭菌进行分子分型研究。【方法】收集来自四川生猪主要产区6个养殖场中猪的粪便标本(n=110),采用厌氧培养技术在艰难梭菌鉴别培养基上进行分离培养;采用PCR方法扩增艰难梭菌4个毒素基因(tcdA、tcdB、cdtA、cdtB)和7个管家基因(adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi),对分离株进行毒素基因分型和多位点序列分型。【结果】从110份样品中,经革兰氏染色镜检及PCR鉴定,共分离出20株艰难梭菌,分离率高达18.18%;毒素基因分型结果显示共获得3种毒素基因型,包括tcdA^(+)tcdB^(+)cdtA/cdtB^(+)(n=3)、tcdA^(+)tcdB^(+)cdtA/cdtB-(n=6)、tcdA-tcdB-cdtA/cdtB-(n=11);多位点序列分型结果显示获得5个ST型,包括ST11 (n=3)、ST3 (n=1)、ST35 (n=2)、ST36 (n=4)、ST109(n=10);进化树结果显示,所有分离株聚集为2个大群,分别为3个分支和17个分支。【结论】四川主要生猪产区猪群存在艰难梭菌感染,分离株的分子分型呈多样性,主要流行型为ST11、ST3、ST35、ST36、ST109型,并且存在ST11型高毒力菌株流行的风险。 展开更多
关键词 四川地区 猪 艰难梭菌 毒素基因分型 多位点序列分型
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