一个硫链丝菌素抗性基因标记、用于DNA导入链霉菌的pSET152衍生载体(英文) 被引量：1

1

作者 邓名荣 郭俊 +1 位作者 冯广达 朱红惠 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1241-1248,共8页

【目的】在链霉菌PCR-targeting系统中,安普霉素是使用最普遍的选择标记。然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后,在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体,如pSET152。这常给研究带来不便,特别是当研究对象基因如一些调... 【目的】在链霉菌PCR-targeting系统中,安普霉素是使用最普遍的选择标记。然而在基因敲除阶段利用安普霉素选择标记后,在遗传补偿时就不能使用相同选择标记的许多重要载体,如pSET152。这常给研究带来不便,特别是当研究对象基因如一些调控基因,其生理功能对剂量敏感时更是如此。基于此,拟以pSET152为基础构建一个不以安普霉素为抗性标记的通用整合型载体。【方法】利用融合PCR和λRed重组等方法构建载体。【结果】来自pHZ1358上的硫链丝菌素抗性基因tsr和来自pCR2.1的氨苄抗性基因bla以"tsr在前bla在后"的次序融合。融合后的抗性片段替换pSET152上的安普霉素抗性基因aac(3)-IV,从而获得新载体pGIM6626。利用该载体将删除的榴菌素最小聚酮合酶基因重新导入到Streptomyces vietnamensis突变株中,该突变株恢复了产榴菌素的能力,证实了该载体的有效性。【结论】构建了一个新的pSET152衍生载体pGIM6626。该载体包含氨苄和硫链丝菌素抗性基因,分别在大肠杆菌和链霉菌中作为选择标记。pGIM6626与pSET152用途相似,但前者由于与PCR-targeting系统不存在选择标记的冲突而与该系统更兼容。 展开更多

关键词 链霉菌 整合型载体 pset152 硫链丝菌素抗性基因 PCR—targeting系统

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生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化 被引量：6

2

作者 沈凤英 李亚宁 +2 位作者 刘力强 吴伟刚 刘大群 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第13期197-201,共5页

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S. scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea Poll.)等多种重... 玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病(S. scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea Poll.)等多种重要的植物病原菌具有很强的抑制作用,有良好的生防应用潜力。为了对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中一些功能基因进行研究,得到高产抗生素的工程菌株,首先应对该菌的遗传转化条件进行优化。作者分别以基因整合型质粒pSET152和基因破坏型质粒pKC1139为出发质粒,ET12567(PUZ8002,pSET152/pKC1139)为供体,Men-myco-93-63孢子和菌丝体为受体,选取MS、PDA、TSB琼脂培养基、燕麦培养基为不同的培养基进行接合转移试验。结果表明MS培养基为接合转移的最适培养基,经验证,已成功地将质粒pSET152/pKC1139转入到了Men-myco-93-63中。以孢子为受体时,孢子预萌发条件为50℃热激10min,37℃温育2.5h,转化效率是10-7～10-6。以菌丝体为受体时,转化效率是10-7～10-6,但菌丝培养过程中容易出现污染。另外,抗生素的覆盖时间对接合转移效率的影响较明显,16～18h覆盖效果最好。 展开更多

关键词 玫瑰黄链霉菌 接合转移 遗传转化 pKC1139 pset152

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不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建 被引量：4

3

作者 杨振娟 孙蕾 +3 位作者 武哲 张俊 檀贝贝 张克诚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期193-198,共6页

旨在对不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传转化体系进行初步的探索及建立。首先对内源质粒的存在及对抗生素敏感性进行了测定,结果显示,在不吸水链霉菌武夷变种CK-15中不存在外源质粒。最终确定最适培养基为MS培养基,最适热激温度与时间... 旨在对不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传转化体系进行初步的探索及建立。首先对内源质粒的存在及对抗生素敏感性进行了测定,结果显示,在不吸水链霉菌武夷变种CK-15中不存在外源质粒。最终确定最适培养基为MS培养基,最适热激温度与时间为50℃热激10 min,37℃温育最适时间为2.5 h,最佳抗生素水溶液覆盖时间为16-18 h,并对转化子进行了验证。 展开更多

关键词 武夷菌素 接合转移 遗传转化 内源质粒 抗性检测 pKC1139 pset152

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固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021接合转移系统的建立及优化 被引量：4

4

作者 王震 庞妃 +4 位作者 顾彩彩 王露蓉 邢永秀 杨丽涛 李杨瑞 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期581-586,共6页

【目的】建立和优化固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术。【方法】以大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZ... 【目的】建立和优化固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术。【方法】以大肠杆菌Escherichia coli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌,进行菌株WZS021接合转移。【结果】选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基,50℃热激10 min,供受比为1∶10,涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素,添加MgCl_2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高,达3.24×10^(-6)。【结论】通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系,有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作。 展开更多

关键词 固氮链霉菌WZS021 接合转移 优化 pset152

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生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化 被引量：3

5

作者 徐萌萌 张红 +3 位作者 何姣 涂璇 颜霞 黄丽丽 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2016年第10期121-125,共5页

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,... 【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。 展开更多

关键词 生防链霉菌gCLA4菌株 接合转移 遗传转化 质粒pset152

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一种多拷贝串联基因的链霉菌表达载体的构建方法 被引量：2

6

作者 吴声栋 方志锴 +1 位作者 郑柏娇 连云阳 《海峡药学》 2016年第2期249-251,共3页

目的建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体p SET152为基础,构建表达载体p FIM001。该质粒携带链霉菌强启动子Perm E*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体p FIM001插入了tcs D基因构建质... 目的建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体p SET152为基础,构建表达载体p FIM001。该质粒携带链霉菌强启动子Perm E*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体p FIM001插入了tcs D基因构建质粒p FIM101,并且引入了XbaⅠ及SpeⅠ等位点;通过表达盒串联定向克隆法完成多拷贝tcs D的插入。结果成功构建外源多拷贝基因表达载体p FIM001,建立了表达盒串联定向克隆法,获得含不同拷贝tcs D基因的质粒。结论可以用这个方法构建多拷贝基因质粒。 展开更多

关键词 多拷贝串联表达 整合型载体pset152 启动子PermE＊ tcsD基因

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玫瑰孢链霉菌SWU2010遗传转化体系的建立和优化

7

作者 马廷梅 柳青 +2 位作者 王磊 胡昌华 廖国建 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期153-158,共6页

玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)是近几年备受关注的抗生素—达托霉素(Daptomycin)的产生菌,具有重要的研究价值和应用前景.目的:为了对Streptomyces roseosporus中的功能基因进行研究,构建达托霉素高产菌株,需要建立一种稳定... 玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)是近几年备受关注的抗生素—达托霉素(Daptomycin)的产生菌,具有重要的研究价值和应用前景.目的:为了对Streptomyces roseosporus中的功能基因进行研究,构建达托霉素高产菌株,需要建立一种稳定、高效的遗传转化体系.方法:以pSET152和pKC1139为载体,探索优化了S.roseosporus SWU2010与大肠杆菌进行接合转移的条件,以此为基础将体外构建的ploxP质粒和带有cre重组酶基因的质粒pALcre先后转入S.roseosporus SWU2010中.结果:AS-1培养基是接合转移的最佳培养基;孢子的预萌发条件为50℃热激10 min,转化效率达10-6～10-5.另外,抗生素覆盖时间16～18 h效果最好.利用已建立的接合转移体系,成功将两侧带有loxP位点的安普霉素抗性基因成功敲除.实验结果为进一步研究达托霉素的生物合成基因和对达托霉素进行组合生物合成改造奠定了基础. 展开更多

关键词 玫瑰孢链霉菌 接合转移 pKC1139 pset152 CRE LOXP

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重叠延伸PCR-酶切连接法构建链霉菌表达载体 被引量：1

8

作者 田平雅 吕苗苗 +3 位作者 杨光耀 马次郎 牛春 张萍 《黑龙江农业科学》 2021年第1期5-10,共6页

在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspor... 在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12 hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠延伸PCR及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体。成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒。双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠延伸PCR技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体。 展开更多

关键词 重叠延伸PCR pset152载体 酶切 连接

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达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379接合转移系统的建立与优化 被引量：2

9

作者 王航 王文轶 +2 位作者 吴旻 彭冉 王旻 《药物生物技术》 CAS 2014年第3期194-198,共5页

玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379是一种具有环脂肽结构抗生素-达托霉素(Daptomycin)的产生菌。建立高效稳定的遗传操作系统是研究该链霉菌各功能基因作用以及构建基因工程菌的基础。实验探索了通过电穿孔、接合转移向... 玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NRRL11379是一种具有环脂肽结构抗生素-达托霉素(Daptomycin)的产生菌。建立高效稳定的遗传操作系统是研究该链霉菌各功能基因作用以及构建基因工程菌的基础。实验探索了通过电穿孔、接合转移向玫瑰孢链霉菌中转入外源DNA的可能性。以链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152-dptP为出发质粒,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电穿孔实验,结果表明:以玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体菌,未获得转化子。以ET12567(PUZ8002,pSET152-dptP)为供体,玫瑰孢链霉菌NRRL11379新鲜菌丝体为受体,选取MS培养基为接合转移培养基,利用属间接合转移将质粒pSET152-dptP转入菌株NRRL11379中。结果表明:当供体大肠杆菌ET12567细胞量和玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌丝体量比例为1∶1,MS培养基中MgCl2的浓度为0.01 mol/L,培养20 h后覆盖阿泊拉霉素50μg/mL以及萘啶酮酸50μg/mL时,接合转移频率最高,可达1.75×10-4。通过PCR验证,质粒pSET152-dptP已整合至玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株的染色体上。确定了玫瑰孢链霉菌属间接合转移的最佳条件。 展开更多

关键词 玫瑰孢链霉菌NRRL11379 达托霉素 pset152 电转化 属间接合转移 优化

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Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus遗传转化体系的建立与优化 被引量：3

10

作者 刘雪娇 牛铭山 +1 位作者 邱荣国 唐莉 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期371-377,共7页

【目的】建立并优化链霉菌Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus的遗传转化系统。【方法】以整合型质粒pSET152为出发质粒,通过供体菌E.coli ET12567/pUZ8002与受体菌Streptomyces pulveraceus进行接合转移。【结果】确定了链霉菌S... 【目的】建立并优化链霉菌Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus的遗传转化系统。【方法】以整合型质粒pSET152为出发质粒,通过供体菌E.coli ET12567/pUZ8002与受体菌Streptomyces pulveraceus进行接合转移。【结果】确定了链霉菌Streptomyces pulveraceus的最佳接合转移条件:培养基为终浓度含15%甘氨酸的MS培养基;孢子热激条件为50°C 10 min;阿伯拉霉素覆盖的时间为18 h,终浓度为20 mg/L。同时,把组成型启动子ermE+与绿色荧光蛋白基因(gfp)克隆到pSET152载体上,通过接合转移整合到该链霉菌中,gfp获得表达。【结论】建立Fostriecin产生菌的遗传转化系统,并发现甘氨酸能显著提高链霉菌的接合转移效率。 展开更多

关键词 链霉菌Streptomyces pulveraceus pset152 接合转移 链霉菌表达

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刺糖多孢菌电转化条件研究 被引量：1

11

作者 张求学 兰周 +3 位作者 汪洋 王昌禄 宋渊 张晓琳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期81-85,共5页

以经理化诱变选育的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)CB11为受体菌,将具有安普霉素(apramycin)抗性标记的整合型载体pSET152作为质粒供体,研究了制备刺糖多孢菌感受态细胞时菌体的生长阶段、质粒DNA浓度、电场强... 以经理化诱变选育的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)CB11为受体菌,将具有安普霉素(apramycin)抗性标记的整合型载体pSET152作为质粒供体,研究了制备刺糖多孢菌感受态细胞时菌体的生长阶段、质粒DNA浓度、电场强度等因素对电转化效率的影响,结果表明,在菌体培养48h至对数中期制备感受态,电场强度为12kV/cm,最小DNA浓度为0.1μg时可获得最高的转化效率,转化子的安普霉素抗性基因的PCR扩增及抗性稳定性实验从分子水平及细胞水平验证了pSET152质粒能整合在刺糖多孢菌的基因组中并能稳定遗传,所有结果表明所建立的刺糖多孢菌电转化体系是行之有效的。 展开更多

关键词 刺糖多孢菌 电转化 质粒 pset152

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