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苹果黑星菌LAMP快速检测方法的建立
1
作者 王华 余海龙 任毓忠 《中国农学通报》 2025年第3期139-144,共6页
由苹果黑星菌(Venturia inaequalis Cook(Wint.))引起的苹果黑星病是全球苹果重要病害之一,严重影响苹果树的长势、产量及果实品质。为了建立简单、快捷和灵敏的苹果黑星病分子检测方法,以新疆伊犁河谷分离鉴定的苹果黑星菌(V.inaequal... 由苹果黑星菌(Venturia inaequalis Cook(Wint.))引起的苹果黑星病是全球苹果重要病害之一,严重影响苹果树的长势、产量及果实品质。为了建立简单、快捷和灵敏的苹果黑星病分子检测方法,以新疆伊犁河谷分离鉴定的苹果黑星菌(V.inaequalis)菌株为试材,基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以病菌核糖体转录间隔区(ITS区)核酸序列为靶标,设计筛选特异性引物,建立苹果黑星菌的LAMP检测体系,并对其特异性和灵敏性进行验证。结果表明,设计的10组引物中Venin7引物能特异性的从4种苹果病害及1种锈病中鉴定出苹果黑星菌,且检测的稳定性好;该LAMP检测体系在扩增温度55℃~70℃、60~90 min以内均对苹果黑星菌有很好的检测效果;对苹果黑星菌的检测灵敏度为1 pg/μL,比特异性引物PCR检测高出103倍以上。本研究建立的LAMP检测技术,可以快速灵敏地对苹果黑星病进行检测和监测。 展开更多
关键词 伊犁河谷 苹果黑星病 环介导等温扩增 病原检测 病害监测 防治 核糖体转录间隔区(ITS区) lamp检测体系
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余甘子果实斑点病菌LAMP可视化检测方法的建立
2
作者 赖多 王德林 +3 位作者 邵雪花 秦健 庄庆礼 肖维强 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期69-79,90,共12页
【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌(Diaporthe ph... 【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌(Diaporthe phoenicicola)的翻译延伸因子EF-1α基因为靶序列,设计LAMP特异性扩增引物;以余甘子间座壳菌DNA为模板,优化反应温度、反应时间、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和内外侧引物浓度比,建立LAMP检测最佳反应体系,测试其特异性和灵敏性,并对余甘子发病果实进行实际检测。【结果】适用于余甘子果实斑点病LAMP检测的最佳引物为引物组合4(EF4-F3/EF4-B3和EF4-FIP/EF4-BIP);LAMP检测最佳反应条件为dNTPs浓度1.0 mmol/L,Mg^(2+)浓度4 mmol/L,内外侧引物质量比6∶1,反应温度63℃,反应时间50 min。优化后的LAMP检测方法可特异性地检出余甘子间座壳菌(D.phoenicicola),检测灵敏度可达0.01 ng/μL,且在实际应用中准确率高达100%。【结论】首次建立了余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌LAMP可视化快速检测方法,该方法特异性强、灵敏度高,操作简单,可用于田间余甘子果实斑点病菌的快速检测。 展开更多
关键词 余甘子 间座壳菌 环介导等温扩增技术 灵敏性 特异性 可视化
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猪圆环病毒3型LAMP-PfAgo检测方法的建立
3
作者 祁钊 余相宇 +1 位作者 陈魏圆 宋祥军 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期1-9,31,共10页
【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守... 【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1~PCV3-T4等4组引物(每组包括1对内引物和1对外引物),以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg ^(2+)浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1~PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、gDNAs浓度、Mn 2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg ^(2+)终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn 2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 PfAgo 环介导等温扩增 即时检验 猪
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地锦叶斑病菌鉴定及LAMP快速检测体系的建立
4
作者 黄成玉 陈健鑫 +3 位作者 郑星月 吴峰婧琳 马焕成 伍建榕 《华南农业大学学报》 北大核心 2025年第1期89-96,共8页
【目的】明确引起云南玉龙县地锦叶斑病的病原种类,并建立快速检测方法。【方法】采用组织分离法分离病原菌,并依据科赫氏法则确定地锦叶斑病病原,通过形态学特征及多基因联合构建系统发育树,明确病原菌的分类地位;以病原菌的Alt a1基... 【目的】明确引起云南玉龙县地锦叶斑病的病原种类,并建立快速检测方法。【方法】采用组织分离法分离病原菌,并依据科赫氏法则确定地锦叶斑病病原,通过形态学特征及多基因联合构建系统发育树,明确病原菌的分类地位;以病原菌的Alt a1基因序列为靶标设计特异性引物建立环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。【结果】地锦叶斑病病原菌鉴定为链格孢菌Alternaria alternata。建立的LAMP反应体系可特异有效地检测出地锦叶斑病菌,该体系最佳反应温度为65℃、最佳反应时间为50 min、最低检测灵敏度为1 pg/μL。使用该体系对人工接种病原菌不同时间的地锦叶片进行链格孢LAMP检测,检出时间为接种12 h及以上。【结论】本研究可为地锦叶斑病的早期检测和科学防控提供理论依据。 展开更多
关键词 地锦 叶斑病 链格孢菌 病原鉴定 lamp体系
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犬C群轮状病毒探针法实时荧光RT-LAMP方法的建立与应用
5
作者 沈海潇 李鑫 +4 位作者 杨德全 葛菲菲 王建 黄士新 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第2期97-104,共8页
旨在建立一种检测犬C群轮状病毒(CRV C)的探针法实时荧光反转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。以病毒基因组的保守序列VP6为靶标,设计合成1组LAMP引物探针,对反应的各项参数进行优化后确定方法的特异性、敏感性等各项指标,进行临床样品... 旨在建立一种检测犬C群轮状病毒(CRV C)的探针法实时荧光反转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。以病毒基因组的保守序列VP6为靶标,设计合成1组LAMP引物探针,对反应的各项参数进行优化后确定方法的特异性、敏感性等各项指标,进行临床样品检测以评估方法的实际效果。结果:该方法检测下限为7.71×10^(0) copies/μL,敏感性与荧光定量RT-PCR相当。重复试验结果的变异系数小于4.35%。与犬A群轮状病毒(CRV A)、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬肠道冠状病毒(CCoV)和犬星状病毒(CaAstV)均无交叉反应。临床样品检测符合率试验表明,本方法与荧光定量RT-PCR方法的总体符合率达到了98.46%(64/65)。综上,本研究建立的探针法实时荧光RTLAMP方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、仪器成本低等优点,可用于CRV C快速检测、临床诊断与疫病监测。 展开更多
关键词 探针法 环介导等温扩增 犬C群轮状病毒 快速检测
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月季3种病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用
6
作者 李振锋 袁志豪 +4 位作者 陆月霞 罗云 黄冬华 王国平 蔡丽 《山西农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期1-9,共9页
[目的]月季是我国重要的观赏花卉,李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、月季潜隐病毒1(rose cryptic virus 1,RCV1)是侵染月季的主要病毒,与其它病毒复合侵染月季... [目的]月季是我国重要的观赏花卉,李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、月季潜隐病毒1(rose cryptic virus 1,RCV1)是侵染月季的主要病毒,与其它病毒复合侵染月季时,对其生长和发育可造成严重影响。本文旨在建立灵敏、便捷地检测月季中这3种病毒的RT-LAMP检测方法。[方法]本研究以病毒CP基因为靶序列设计特异性引物,建立侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的RT-LAMP检测方法,并对反应体系中Mg^(2+)浓度和dNTP使用浓度、反应温度和反应时间进行了优化,并对反应灵敏度和特异性进行了检测。[结果]该方法在恒温条件(61℃)下即可对目标病毒实现可视化特异性检测,检测体系中Mg^(2+)和dNTP最佳使用浓度分别为5.0 mmol/L和1.2 mmol/L;本研究所建立的RT-LAMP检测方法,RCV1、PNRSV和ASGV可以检测到病毒的最低浓度分别为3.19×10^(5)、6.44×10^(4)和4.04×10^(4)拷贝/μL,灵敏度是RT-PCR的100~1000倍,而且检测体系具有很好的反应特异性,与侵染月季的其它病毒之间不存在交叉反应;使用该RT-LAMP检测方法随机对田间19个样品进行检测,可通过颜色变化,能准确检测出样品中的目标病毒,而无需借助琼脂糖凝胶电泳或其它专门仪器。[结论]该方法可通过直接添加染料实现可视化,具有快速、便捷、特异性好特点,适用于侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的快速诊断及田间监测。 展开更多
关键词 月季 病毒 RT-lamp 检测方法
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草莓滑刃线虫LAMP检测方法的建立
7
作者 俞禄珍 李帅 +3 位作者 林宇 崔金璐 赵亚津 宋绍祎 《植物检疫》 2025年第1期35-38,共4页
草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragariae)是一种叶和芽寄生线虫,可侵染250多种植物,被列入我国检疫性有害生物名录。本研究通过比较GenBank数据库中滑刃属线虫相关序列,以草莓滑刃线虫rDNA-ITS序列为靶标,设计草莓滑刃线虫LAMP特异性引... 草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragariae)是一种叶和芽寄生线虫,可侵染250多种植物,被列入我国检疫性有害生物名录。本研究通过比较GenBank数据库中滑刃属线虫相关序列,以草莓滑刃线虫rDNA-ITS序列为靶标,设计草莓滑刃线虫LAMP特异性引物,建立了可视化LAMP反应检测体系,并采用目标线虫及近似种线虫DNA进行引物特异性验证。结果表明,本研究建立的LAMP检测方法可在1 h内对草莓滑刃线虫进行检测,供试其他22种植物线虫均未发生非特异性扩增,仅草莓滑刃线虫出现扩增,具有良好的物种特异性;检测灵敏度可达1/250条草莓滑刃线虫;检测结果可以直接用肉眼判断。因此,本方法具有反应时间短、灵敏度高、设备要求低的优点,适于基层实验室开展草莓滑刃线虫检测。 展开更多
关键词 草莓滑刃线虫 lamp 快速检测 RDNA-ITS
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miR-207靶向自噬相关蛋白LAMP2调控巨噬细胞与结核分枝杆菌相互作用机制的研究
8
作者 杜文雅 代禹美 +2 位作者 乐林芝 马涛 吴利先 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期97-104,共8页
目的miR-207被发现在自然杀伤(NK)细胞外泌体中表达,参与疾病进展,但暂无与结核病(TB)有关的研究。方法生物信息学方法预测并用双荧光素酶报告实验检测溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)是否与miR-207有靶向关系。使用脂质体转染法将实验分为四... 目的miR-207被发现在自然杀伤(NK)细胞外泌体中表达,参与疾病进展,但暂无与结核病(TB)有关的研究。方法生物信息学方法预测并用双荧光素酶报告实验检测溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)是否与miR-207有靶向关系。使用脂质体转染法将实验分为四组(OP-LAMP2组:共转染miR-207 mimics和LAMP2过表达质粒;EP组:共转染mimics NC和空载质粒;siLAMP2组:转染siLAMP2;siLAMP2-NC组:转染siLAMP2-NC)。使用H37Ra感染Ana-1细胞建立结核感染模型。结核菌落形成单位计数评估LAMP2对胞内分枝杆菌负荷的影响以及对胞外残留分枝杆菌的清除作用。流式细胞术检测细胞总凋亡率。实时荧光定量PCR检测LAMP2、细胞凋亡基因、焦亡基因及自噬基因相对表达量。Western blot法检测LAMP2蛋白、细胞凋亡、焦亡、自噬蛋白的相对表达量。结果双荧光素酶报告实验检测显示miR-207与LAMP2存在靶向关系,实时荧光定量PCR、Western blot结果统计分析和显微镜下观察证明成功建立感染模型。菌落形成单位计数发现OP-LAMP2组的菌落数低于EP组,siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。流式细胞术检测发现OP-LAMP2组总凋亡率低于EP组,siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。实时荧光定量PCR及Western blot法检测发现对照组凋亡、焦亡相关蛋白和基因相对表达量趋势为OP-LAMP2低于EP组,siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。实时荧光定量PCR检测自噬正调节基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)和重组人自噬效应蛋白(Beclin1)在OP-LAMP2组相对表达量高于EP组,siLAMP2组低于siLAMP2-NC组,负调节自噬基因相对表达量与自噬正调节基因趋势相反。自噬相关蛋白相对表达量与自噬基因趋势一致。结论miR-207通过靶向自噬相关蛋白LAMP2促进巨噬细胞凋亡、细胞焦亡、抑制自噬,促进结核分枝杆菌(Mtb)的存活,为TB提供新的治疗方向。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌(Mtb) miR-207 lamp2 自噬 凋亡 焦亡
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基于沙门菌属LAMP检测的食品卫生检验优化方法
9
作者 甘方勇 《现代食品》 2025年第1期196-199,共4页
沙门菌是一种常见的食源性病原体,能够引起沙门菌感染,导致食物中毒,严重时甚至可危及生命。优化检测方法对于快速准确地识别污染源、防止疾病的传播至关重要。本文通过对比传统的分离培养法,发现环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isot... 沙门菌是一种常见的食源性病原体,能够引起沙门菌感染,导致食物中毒,严重时甚至可危及生命。优化检测方法对于快速准确地识别污染源、防止疾病的传播至关重要。本文通过对比传统的分离培养法,发现环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)在检测速度、操作简便性和成本效益方面具有显著优势。实验结果表明,LAMP方法远快于分离培养法,且LAMP法的操作步骤简单,不需要复杂的设备和高技能的操作人员,能够有效降低成本。 展开更多
关键词 沙门菌属 环介导等温扩增技术(lamp) 食品检测
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H3 、 N2和N8亚型禽流感病毒三重RT-LAMP检测方法的建立与应用
10
作者 黄青红 谢芝勋 +5 位作者 李孟 李丹 罗思思 张民秀 谢丽基 余丹 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期1-9,共9页
为快速鉴别检测H3、N2和N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),建立了一种可同时检测H3、N2、N8亚型AIV的三重RT-LAMP(triplex reverse transcript loop-mediated isothermal amplification,tRT-LAMP)方法。根据NCBI中H3、N2和N... 为快速鉴别检测H3、N2和N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),建立了一种可同时检测H3、N2、N8亚型AIV的三重RT-LAMP(triplex reverse transcript loop-mediated isothermal amplification,tRT-LAMP)方法。根据NCBI中H3、N2和N8亚型AIV的NA基因保守序列分别设计3套LAMP引物,同时还设计了与FIP的F1c反向互补的荧光探针(FD),并通过退火的方式将FD结合到标记淬灭基团的FIP(FIP)上,形成FIP-FD复合探针后的荧光被淬灭,当FD与FIP分离后,可检测到荧光信号。通过优化反应温度、特异性、敏感性、干扰性和临床样品检测等成功建立了同时检测H3、N2、N8亚型AIV的tRT-LAMP方法。该方法只需要67℃恒温条件就能准确检测和鉴别AIV的3种不同目的基因,且检测其他相关的禽类病原时不产生非特异性扩增;每反应管检测H3、N2和N8亚型AIV最低限度分别为756、735、790 copies/μL,不同浓度模板之间互不干扰;临床样品检测结果显示,tRT-LAMP结果与RT-qPCR及测序结果完全一致。结果表明该方法具有快速、经济、灵敏和特异的优点,扩增结果还可直接肉眼观察,可应用于临床同时检测H3、N2和N8亚型禽流感病毒。 展开更多
关键词 三重荧光RT-lamp H3N8亚型禽流感 H3N2亚型禽流感 复合探针
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地黄花叶病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用
11
作者 秦艳红 鲁书豪 +5 位作者 文艺 高素霞 李绍建 刘玉霞 王飞 鲁传涛 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期246-253,共8页
基于反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了针对地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据ReMV外壳蛋白(coat protein,... 基于反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术建立了针对地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)的快速、特异、灵敏的RT-LAMP检测方法。根据ReMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列设计了3组LAMP引物,通过引物筛选确定最佳引物组合;利用电泳检测及可视化方法(加SYBR GreenⅠ显色剂)进行RT-LAMP温度优化、特异性检测、灵敏度比较。结果表明:本研究建立的RT-LAMP方法最适检测温度为60℃,优化后的LAMP方法能特异性检测ReMV,灵敏度是常规PCR的1000倍,可检测到1.2×10^(-1)拷贝/μL的模板浓度。对60份地黄样品的检测结果表明,RT-LAMP方法的阳性检出率为98.3%,高于常规RT-PCR方法(75%)。本研究建立的RT-LAMP检测技术为ReMV的准确检测提供了快速、高效的方法。 展开更多
关键词 地黄花叶病毒 反转录环介导等温扩增(RT-lamp) 快速检测
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三七根腐病菌尖孢镰刀菌实时荧光LAMP检测体系的建立及应用
12
作者 李有玉 顾悦 +2 位作者 甘昆发 崔秀明 刘迪秋 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第S1期237-244,共8页
为了实现对三七根腐病菌的快速准确诊断、及时阻断病菌传播、开展针对性防治,建立了一种现场快速检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的实时荧光LAMP技术。首先从GenBank中筛选出尖孢镰刀菌类跨膜蛋白(TP)基因,并针对其保守区域设计了一套LAMP... 为了实现对三七根腐病菌的快速准确诊断、及时阻断病菌传播、开展针对性防治,建立了一种现场快速检测三七根腐病菌尖孢镰刀菌的实时荧光LAMP技术。首先从GenBank中筛选出尖孢镰刀菌类跨膜蛋白(TP)基因,并针对其保守区域设计了一套LAMP特异性引物,通过对尖孢镰刀菌LAMP检测体系的反应温度、内引物、外引物、环引物、Mg^(2+)、dNTPs浓度进行优化,并评价体系的特异性及灵敏性,最后应用建立的LAMP检测方法分析三七病株及土壤样品中尖孢镰刀菌的含量。结果表明,LAMP检测方法最佳反应条件为:反应温度64℃,内引物、外引物以及环引物的最佳浓度分别为1.6,0.2,0.1μmol/L,Mg^(2+)浓度6 mmol/L,dNTPs浓度0.4 mmol/L。利用建立的LAMP检测体系能从7种三七根腐病菌中特异性检测出尖孢镰刀菌,且灵敏度高,检测的最低模板浓度为0.2 pg/μL。此外,将DNA简提法和钙黄绿素指示剂与LAMP检测体系结合,建立了一种三七根腐病菌尖孢镰刀菌的现场快速检测方法,可快速准确检测三七植株及种植土壤中的尖孢镰刀菌,为土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗流通过程中的带菌分子检测提供技术支持。 展开更多
关键词 三七根腐病 尖孢镰刀菌 类跨膜蛋白基因 实时荧光lamp
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鸡圆圈病毒3型可视化LAMP检测方法的建立及应用 被引量：2
13
作者 张民秀 谢芝勋 +6 位作者 张艳芳 谢志勤 谢丽基 李孟 罗思思 曾婷婷 王粲 《河南农业科学》 北大核心 2024年第4期128-136,共9页
建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方... 建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。 展开更多
关键词 鸡圆圈病毒3型(GyV3) 可视化lamp 特异性引物 诊断方法 敏感性
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鸽新城疫病毒可视化LAMP检测方法的建立与应用 被引量：1
14
作者 唐艳荣 张小梅 +3 位作者 郭建立 曹院章 张海云 李壹 《中国家禽》 北大核心 2024年第3期120-124,共5页
为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAM... 为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法。结果显示:建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型鸽新城疫病毒,与H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、小鹅瘟病毒以及禽白血病病毒以及新城疫病毒La Sota疫苗株均无交叉反应,最低检测限为10^(1)copies/μL。研究表明所建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法快速、简便,特异性强,灵敏度高,可应用于基层快速检测鸽Ⅰ型副黏病毒。 展开更多
关键词 鸽新城疫 lamp 可视化 检测
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基于LAMP技术的欧洲樱桃绕实蝇检测方法的建立
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作者 刘玮琦 赵畅 +6 位作者 姜帆 李兰 陈超 丛日赫 梁靓 杨东来 郑敏 《植物检疫》 2024年第6期23-30,共8页
在机场、海港和陆运口岸等入境场所建立快速的现场检疫鉴定方法能够有效防止外来有害生物通过全球商品贸易、旅客携带等方式进行传播和扩散,从而避免造成严重的经济损失。本研究根据欧洲樱桃绕实蝇线粒体细胞色素COI基因序列设计特异的L... 在机场、海港和陆运口岸等入境场所建立快速的现场检疫鉴定方法能够有效防止外来有害生物通过全球商品贸易、旅客携带等方式进行传播和扩散,从而避免造成严重的经济损失。本研究根据欧洲樱桃绕实蝇线粒体细胞色素COI基因序列设计特异的LAMP引物,分别研制了可视化LAMP检测方法和实时荧光LAMP检测方法。结果表明,优化后的可视化LAMP检测体系在62℃、40 min内可检测低至10pg/μL的欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA,且不与其他近似种样品发生交叉反应,可以裸眼直接判断检测结果,具有好的特异性;实时荧光LAMP检测方法的最低检测限为10 ng/μL,检测时间约需90 min。本研究建立的快速、准确、灵敏的可视化恒温扩增体系,可以应用于欧洲樱桃绕实蝇的现场快速检测。 展开更多
关键词 欧洲樱桃绕实蝇 lamp 检测
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草莓白化伴随病毒RT-LAMP检测方法的建立
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作者 王涌 曾祥国 +4 位作者 肖桂林 温昕 周鑫鑫 邓江丽 韩永超 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期237-245,253,共10页
草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-... 草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),对反应体系的各条件进行评估优化后,检测了RT-LAMP的特异性和灵敏度,且对田间样品进行了测试。结果表明,优化后的反应体系包含2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer、6 mmol/L Mg^(2+)、1 mmol/L dNTPs、1μmol/L SPaV-FIP和SPaV-BIP,0.1μmol/L SPaV-F3和SPaV-B3,0.3μmol/L SPaV-LB,0.4 mol/L Betaine,0.256 U/μL WarmStart Bst 2.0 DNA Polymerase,0.12 U/μL WarmStart RTx Reverse Transcriptase,1μL RNA,反应条件为61℃恒温孵育40 min。采用优化后的反应体系,在特异性检测中,只有携带了病毒SPaV的样品才能发生阳性扩增。灵敏度测试中,RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高10倍。田间应用中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致。本研究建立的SPaV RT-LAMP检测方法操作简便、快速、特异,可供实验室及生产实践中应用,助力脱毒种苗的鉴定和田间病毒病调查。 展开更多
关键词 草莓白化伴随病毒 反转录环介导等温扩增 可视化 快速检测
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鳞球茎茎线虫LAMP检测方法的建立
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作者 俞禄珍 李帅 +2 位作者 于子翔 赵亚津 宋绍祎 《植物检疫》 2024年第6期31-34,共4页
鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)能引起多种植物毁灭性病害,是世界公认的危险性线虫,被列入我国检疫性有害生物名录。本研究通过比较GenBank数据库中茎属线虫相关序列,以鳞球茎茎线虫rDNA-ITS序列为靶标,设计鳞球茎茎线虫LAMP特异性... 鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)能引起多种植物毁灭性病害,是世界公认的危险性线虫,被列入我国检疫性有害生物名录。本研究通过比较GenBank数据库中茎属线虫相关序列,以鳞球茎茎线虫rDNA-ITS序列为靶标,设计鳞球茎茎线虫LAMP特异性引物,建立了可视化LAMP检测体系。结果表明,本研究建立的LAMP检测方法可在1 h内对鳞球茎茎线虫进行检测,供试其他22种植物线虫均未出现扩增,仅鳞球茎茎线虫出现扩增,具有良好的特异性;检测灵敏度可达1/4000条鳞球茎茎线虫;检测结果可以直接用肉眼判断。因此,本方法具有反应时间短、灵敏度高、设备要求低的优点,适于基层实验室开展鳞球茎茎线虫检测。 展开更多
关键词 鳞球茎茎线虫 lamp 检测 RDNA-ITS
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虾类十足目虹彩病毒1(DIV1)LAMP-HNB快检方法的建立
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作者 王雯琼 葛明峰 +4 位作者 卢先东 刘艳红 斯烈钢 申屠基康 徐胜威 《安徽农业科学》 CAS 2024年第15期192-196,共5页
[目的]建立一种操作简便、快速、可视化的虾类病原检测方法,实现基层养殖户自检。[方法]针对十足目虹彩病毒1(DIV1),设计环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对反应试剂用量、温度、反应时间等条件进行优化,建立LAMP与羟基萘酚蓝(HNB)结合... [目的]建立一种操作简便、快速、可视化的虾类病原检测方法,实现基层养殖户自检。[方法]针对十足目虹彩病毒1(DIV1),设计环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对反应试剂用量、温度、反应时间等条件进行优化,建立LAMP与羟基萘酚蓝(HNB)结合的LAMP-HNB可视化快速检测方法。[结果]在LAMP反应体系中添加12 mmol/L Mg^(2+)和250μmol/L HNB,65℃恒温条件下反应60 min最佳;DIV1病原质粒最低检出限为102 copies/μL,稳定性和特异性较好,通过带有靶标基因的阳性质粒进行16次重复性试验结果均较为稳定,多种模板扩增试验均未发生假阳性情况,符合试验要求。[结论]该研究建立的LAMP-HNB可视化快速检测方法,适用于上述对虾DIV1的现场快速检测。 展开更多
关键词 南美白对虾 lamp HNB 十足目虹彩病毒1 快速检测
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华支睾吸虫LAMP方法的建立与初步应用
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作者 孙晓敬 马茜 +4 位作者 田甜 张磊 刘丽君 姚佳 汪洋 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第13期47-51,共5页
为了建立华支睾吸虫环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,试验利用GenBank中华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的线粒体全基因组设计特异性引物,然后构建LAMP方法,并验证了LAMP方法的特异性和敏感... 为了建立华支睾吸虫环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,试验利用GenBank中华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的线粒体全基因组设计特异性引物,然后构建LAMP方法,并验证了LAMP方法的特异性和敏感性;以及用粪便镜检(金标准)、PCR和LAMP方法同时检测45份犬粪便样本,评价LAMP方法的检测效果。结果表明:经序列比对,筛选得到华支睾吸虫特异性基因Unit R2,以该基因序列为靶标构建检测方法,优化后的总体积为50μL,Bst3.0 DNA聚合酶的最适用量为1μL,MgSO_(4)的最适浓度为6 mmol/L,最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为40 min。构建的LAMP方法可以检测华支睾吸虫整个生命发育周期,实现了对其成虫、嚢蚴及虫卵的全方位覆盖;与其他种类寄生虫无交叉反应;对基因组DNA的最低检测限为10 fg,是PCR方法的100倍;与金标准相比,LAMP方法的特异性为100%(30/30),敏感性为93.33%(14/15)。说明试验建立的华支睾吸虫LAMP方法特异性强、敏感性高、检测结果准确,具有快速检测华支睾吸虫的潜力。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 环介导等温扩增(lamp) 线粒体基因组 核酸 检测
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对虾白斑综合症病毒LAMP-TaqMan检测方法的建立及应用
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作者 刘昱 柳梦思 +3 位作者 董振国 焦义然 时国强 石磊 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期63-68,共6页
为提高环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法的特异性,本研究建立一种LAMP-TaqMan检测方法,进行对虾白斑综合症病毒(WSSV)核酸检测。本研究以WSSV基因组中保守序列构建测试质粒并设计筛选LAMP引物组,以荧光淬灭集团修饰的环引物作为TaqMan... 为提高环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法的特异性,本研究建立一种LAMP-TaqMan检测方法,进行对虾白斑综合症病毒(WSSV)核酸检测。本研究以WSSV基因组中保守序列构建测试质粒并设计筛选LAMP引物组,以荧光淬灭集团修饰的环引物作为TaqMan探针,建立LAMP-TaqMan检测方法。结果显示:LAMP-TaqMan法在WSSV检测中,具备良好的特异性,最适检测温度为63℃,测试质粒线性相关性系数R^(2)为0.990,最低检出限为0.76×10^(1)copies/μL,重复性检测结果的变异系数CV值均小于3%,稳定性良好;以市售检测试剂盒为对照,对60份对虾样品进行平行测试,LAMP-TaqMan检测准确率为96.67%,敏感性为100.00%。建立的LAMP-TaqMan恒温核酸检测方法具备精准快速,检出限低,有效避免LAMP非特异性扩增造成的“假阳性”等优势,在水产疫病精准快速检测中具有广泛的市场应用前景。 展开更多
关键词 lamp TAQMAN探针 对虾白斑综合症病毒 核酸检测
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