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TAT PTD-Tachyplesin融合基因的重叠延伸PCR法合成 被引量:6
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作者 邱道寿 刘晓津 +1 位作者 王军 苏永全 《安徽农业科学》 CAS 2013年第4期1438-1441,共4页
为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物... 为探讨HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)对中国鲎抗菌肽tachyplesin的协同作用,试验以经毕赤酵母密码子优化后的tachyplesin成熟肽(54 aa)加TAT PTD(11 aa)的cDNA序列为参考模板,设计了6条单链寡核苷酸片段,首尾引物的5'端分别引入EcoR I和Xba I酶切位点,通过重叠延伸PCR方法成功合成了TAT PTD+Tachyplesin序列,序列全长219 bp,为其后续功能与协同作用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 ptd tat 鲎素 重叠延伸PCR
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Artificial Synthesis of TAT PTD-Tachyplesin Fusion Gene by Overlap Extension PCR
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作者 Daoshou QIU Xiaojin LIU +1 位作者 Jun WANG Yongquan SU 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2013年第3期1-4,17,共5页
This study aimed to investigate the synergism of the TAT PTD ( protein transduction domain in HIV-1 transactivator of transcription protein) to antibacte- rial peptide tachyplesin from Tachp/eus tr/dentatus. Treated... This study aimed to investigate the synergism of the TAT PTD ( protein transduction domain in HIV-1 transactivator of transcription protein) to antibacte- rial peptide tachyplesin from Tachp/eus tr/dentatus. Treated with Pichia pastoris preferred codon optimization, using the eDNA sequence of tuchyplesin mature pep- tide (54 aa) harboring TAT FFD sequence (11 aa) as reference template, six single-stranded oligonueleotides were designed, the sequences of restriction sites EcoR I and Xba I were introduced to the 5' end of primers P1 and P6, respectively. TAT PTD + Tachyplesin fusion gene with a full length of 219 bp was artificially synthesized by overlap extension PCR, which laid the preliminary foundation for subsequent functional and synergism studies. 展开更多
关键词 tat protein transduetion domain (tat ptd) TACHYPLESIN Overlap extension PCR
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hCu,Zn-SOD-TAT PTD的融合表达及其跨膜转运性质的初步研究 被引量:5
3
作者 汪飞鹏 桂向东 宋礼华 《药物生物技术》 CAS CSCD 2004年第1期11-15,共5页
HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPT... HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPTD编码序列的 3’引物PCR扩增得hCu ,Zn SOD TATPTD融合基因 ,并插入 pUC19。将SOD基因和SOD TATPTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体 pJW 2 ,转化大肠杆菌DH5α。SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,热击诱导 4h后 ,分别在 19ku和 2 2ku处出现SOD和SOD TATPTD目标表达条带 ,表达蛋白以包含体形式存在。分别提取SOD和SOD TATPTD包含体 ,复性纯化后SOD和SOD PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性 ,其比活性分别为 12× 10 3 NU/mg和 9.9× 10 3 NU/mg。细胞试验结果表明 ,与SOD相比较 ,SOD TATPTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力。 展开更多
关键词 SOD-tat ptd融合蛋白 原核表达 蛋白转导
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HIV-Tat蛋白转导域在医学研究中的应用 被引量:8
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作者 丁劲 马斌 +1 位作者 刘军 薛采芳 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第6期6-8,13,共4页
HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高... HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具 。 展开更多
关键词 HIV-tat蛋白转导域 人免疫缺陷病毒反式激活蛋白 生物膜 运载工具 目的蛋白
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HIV TAT——一种生物大分子的运载体 被引量:8
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作者 严世荣 丁爱玲 +1 位作者 朱明磊 张红梅 《药物生物技术》 CAS CSCD 2002年第4期187-190,共4页
人工合成编码TAT蛋白转导区核心区域11个氨基酸的双链寡核苷酸,构建pET28a-TAT-LacZ表达子,转化大肠杆菌,得到高表达的TAT-β-Gal融合蛋白。TAT-β-Gal加入体外培养的平滑肌细胞中,15min细胞即出现蓝染,1h TAT-β-Gal 100%进入细胞。... 人工合成编码TAT蛋白转导区核心区域11个氨基酸的双链寡核苷酸,构建pET28a-TAT-LacZ表达子,转化大肠杆菌,得到高表达的TAT-β-Gal融合蛋白。TAT-β-Gal加入体外培养的平滑肌细胞中,15min细胞即出现蓝染,1h TAT-β-Gal 100%进入细胞。该融合蛋白ip到Wistar大鼠体内,30min各组织出现蓝染,4h光密度值达高峰。实验证明TAT蛋白可有效携带大分子物质穿过生物膜,是一良好的生物大分子运载体。 展开更多
关键词 蛋白转导区 pET28a-tat-LacZ表达子 融合蛋白 大分子运载体 生物大分子
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TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 被引量:6
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作者 曲恒燕 刘泽源 +1 位作者 李媛媛 孙曼霁 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期442-446,共5页
目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y... 目的确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用。结果成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞。对Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率。结论TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性。 展开更多
关键词 睫状神经营养因子 蛋白转导域 tat 细胞膜 AΒ25-35 凋亡
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Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性 被引量:2
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作者 丁劲 刘军 +4 位作者 黄豫晓 李英辉 陈俊 赵亚 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期587-590,共4页
目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(D... 目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 tat p53 蛋白转导域 肿瘤 融合蛋白 活性分析 野生型P53基因 纯化 HepG2细胞 原核表达载体
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TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性 被引量:2
8
作者 王海珍 许予明 +2 位作者 李增富 杨静 张云汉 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2007年第10期865-867,共3页
目的构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达... 目的构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础. 展开更多
关键词 tat 蛋白转导结构域 重组融合蛋白质类 PC12细胞
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TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导 被引量:1
9
作者 周洲 李永丽 +1 位作者 源春彦 曲良建 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1361-1367,共7页
【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-D... 【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。 展开更多
关键词 舞毒蛾 滞育激素 tat穿膜肽 蛋白转导域 融合蛋白 跨膜运输
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TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达 被引量:1
10
作者 王海珍 许予明 +3 位作者 赵莘瑜 陈奎生 李惠翔 张云汉 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2007年第3期461-463,共3页
目的构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达并纯化。方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子。转化大肠杆菌,IPTG诱... 目的构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达并纯化。方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子。转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果及结论成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础。 展开更多
关键词 tat 蛋白转导结构域 融合蛋白
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TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究 被引量:1
11
作者 严世荣 严洁 +1 位作者 龚坚 李蓓 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2002年第4期343-345,350,共4页
为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在... 为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。 展开更多
关键词 tat-β-半乳糖苷酶 小鼠 生物膜穿透性 pET28a-tat-LacZ重组表达子 tat-β-Gal融合蛋白 蛋白转导区
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TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用 被引量:1
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作者 刘树滔 何火聪 +3 位作者 陈菁 傅蓉 潘剑茹 饶平凡 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2010年第6期463-466,I0003,I0004,共6页
目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这... 目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。 展开更多
关键词 tat蛋白转导结构域 融合蛋白 跨膜递送 皮肤 器官
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TAT蛋白在介导外源物质进入细胞方面的应用 被引量:1
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作者 江晓曦 郑文岭 +1 位作者 崔东 马文丽 《生物技术通报》 CAS CSCD 2003年第5期6-8,共3页
TAT蛋白能够介导多肽、蛋白质、基因等外源物质进入细胞 ,对机体没有毒性 ,对周围环境的影响也不敏感 ,因而可以直接应用于组织细胞。它能够引导外源基因定位于细胞核 ,具有其它介导方法所没有的优点。这些优点将使TAT蛋白在研究蛋白质... TAT蛋白能够介导多肽、蛋白质、基因等外源物质进入细胞 ,对机体没有毒性 ,对周围环境的影响也不敏感 ,因而可以直接应用于组织细胞。它能够引导外源基因定位于细胞核 ,具有其它介导方法所没有的优点。这些优点将使TAT蛋白在研究蛋白质功能、基因治疗等方面发挥极为重要的作用。TAT蛋白与细胞表面进行低亲和力的结合 ,以Caveolae途径进入细胞 。 展开更多
关键词 tat蛋白 介导 外源物质 细胞 艾滋病毒
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利用TAT多肽增强腺病毒对细胞感染效率的研究
14
作者 党颖 朱旭东 +3 位作者 王应雄 李涛 王宇新 黄培堂 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第7期50-53,共4页
蛋白转导多肽本身或携带生物大分子能以一种不明机制的方式高效地穿过真核细胞质膜并且几乎没有组织选择性。这为生物药物研究、基因治疗等领域带来了新的希望。最近有研究表明:来源于HIV-1的TAT蛋白的蛋白转导结构域多肽可以显著地提... 蛋白转导多肽本身或携带生物大分子能以一种不明机制的方式高效地穿过真核细胞质膜并且几乎没有组织选择性。这为生物药物研究、基因治疗等领域带来了新的希望。最近有研究表明:来源于HIV-1的TAT蛋白的蛋白转导结构域多肽可以显著地提高重组腺病毒感染细胞和实验动物的效率。在对。HeLa且和Vero-E62种具有不同病毒易感性的细胞进行重组腺病毒感染实验时发现TAT多肽可以明显地提高重组腺病毒对HeLa细胞的感染及在细胞中外源报道基因的表达,但是对Vero-E6细胞却没有效果,表明TAT多肽增强重组腺病毒的感染与靶细胞类型有关,而并不像转导现象那样没有组织差异。这为蛋白转导技术在病毒载体中的应用提供了参考,但其中涉及的蛋白转导的机制有待进一步实验研究。 展开更多
关键词 多肽 重组腺病毒 蛋白转导 HeLa细胞 tat蛋白 HIV-1 细胞质膜 药物研究 基因治疗 实验动物 感染细胞 报道基因 感染实验 细胞类型 病毒载体 实验研究 分子能 结构域 易感性 组织 机制 生物 真核 表达
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PreS-Tat真核表达载体的构建及表达
15
作者 张祥 阚全程 +1 位作者 余祖江 王鹏 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2011年第5期706-709,共4页
目的:构建pEGFP-PreS-Tat嵌合载体并在真核细胞中表达。方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法扩增出PreS片段,定向克隆入pEGFP-C3载体,在PreS下游连接合成的Tat序列,构建成功的pEGFP-PreS-Tat质粒经脂质体转染Hela细胞,Westernblot鉴定目... 目的:构建pEGFP-PreS-Tat嵌合载体并在真核细胞中表达。方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法扩增出PreS片段,定向克隆入pEGFP-C3载体,在PreS下游连接合成的Tat序列,构建成功的pEGFP-PreS-Tat质粒经脂质体转染Hela细胞,Westernblot鉴定目的蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明成功地构建了pEGFP-PreS-Tat嵌合载体,WesternBlot结果表明该载体能在Hela细胞中表达pEGFP-PreS-Tat融合蛋白。结论:成功构建pEG-FP-PreS-Tat载体并表达出相应的融合蛋白,为研究该融合蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 PRES tat 乙型肝炎病毒 蛋白转导区
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TAT/LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究
16
作者 郑文杰 罗刚 +2 位作者 向强 李长青 周跃 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第20期2093-2097,共5页
目的:表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT/LMP-3,观察融合蛋白TAT/LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能.方法:采用基因工程技术构建原核表达载体pET43.1a-TAT/LMP-3和pET43.1a-LM... 目的:表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT/LMP-3,观察融合蛋白TAT/LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能.方法:采用基因工程技术构建原核表达载体pET43.1a-TAT/LMP-3和pET43.1a-LMP-3并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体.将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响.结果:成功地构建了pET43.1a-TAT-LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT/LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT/LMP-3纯度大于90%.成功制备了TAT/LMP-3的兔源性多克隆抗体.Western Blot分析证实TAT-LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT/LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化.结论:成功进行了TAT/LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT/LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础. 展开更多
关键词 tat 蛋白转导结构域 重组融合蛋白质类 人骨髓间充质千细胞 诱导成骨
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融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化
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作者 戚华兵 汪仕良 王凤君 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第22期2213-2215,共3页
目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表... 目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。 展开更多
关键词 原核表达系统 tat蛋白转导结构域 缺氧诱导因子1Α PAS—B结构域
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TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化
18
作者 赵兴卉 朱旭东 +1 位作者 吴国清 黄培堂 《生物技术通讯》 CAS 2005年第1期22-24,共3页
利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指文库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET-TAT-NLS中,构建融合蛋... 利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指文库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET-TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS-clone3。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18%;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。 展开更多
关键词 tat 蛋白质转导结构域 SV40启动子 三锌指结构 融合蛋白 可溶性表达 纯化
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p53-TAT融合蛋白的克隆表达及其对HepG 2细胞的促凋亡作用
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作者 陈灼娟 杨志强 孟春 《海峡药学》 2012年第12期272-275,共4页
目的研究连接TAT蛋白转导域的p53融合蛋白对人肝癌细胞株HepG 2的促凋亡作用。方法用反转录法从人正常肝细胞株L-02中获得野生型p53基因cDNA,构建原核表达质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT。IPTG诱导表达重组蛋白,重组蛋白经N-i NTA柱... 目的研究连接TAT蛋白转导域的p53融合蛋白对人肝癌细胞株HepG 2的促凋亡作用。方法用反转录法从人正常肝细胞株L-02中获得野生型p53基因cDNA,构建原核表达质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT。IPTG诱导表达重组蛋白,重组蛋白经N-i NTA柱纯化后,加入HepG 2细胞培养液上清,采用四唑氮盐比色法(MTT法)和单细胞凝胶电泳法检测p53及p53-TAT融合蛋白对HepG 2细胞生长的影响。结果成功构建质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT,表达纯化了p53蛋白及p53-TAT蛋白。MTT法和单细胞凝胶电泳法结果表明,与p53蛋白相比,p53-TAT融合蛋白能更有效地抑制HepG 2细胞生长、促进凋亡。结论 p53-TAT融合蛋白能够有效促进HepG 2细胞凋亡。 展开更多
关键词 P53 tat蛋白转导域 克隆 细胞凋亡
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Tat-p53融合蛋白在乳腺癌细胞的表达、纯化及其转导活性
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作者 于文慧 陈飞 李志高 《现代肿瘤医学》 CAS 2013年第8期1709-1712,共4页
目的:研究Tat-p53融合蛋白在乳腺癌细胞的表达、纯化及其转导活性,探讨蛋白转导方法在乳腺癌治疗中应用的可能性。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因克隆入pTAT-HA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内... 目的:研究Tat-p53融合蛋白在乳腺癌细胞的表达、纯化及其转导活性,探讨蛋白转导方法在乳腺癌治疗中应用的可能性。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因克隆入pTAT-HA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。将Tat-p53融合蛋白加入MCF-7人乳腺癌细胞培养上清,检测Tat-p53融合蛋白导入MCF-7人乳腺癌细胞的情况。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白,证实Tat-p53可以高效转入MCF-7人乳腺癌细胞内。结论:TatPTD可以发挥高效的蛋白转导特性将p53导入人乳腺癌细胞,p53在细胞核内可以发挥生物学活性,抑制肿瘤细胞生长并诱导其发生凋亡。 展开更多
关键词 tat P53 蛋白转导域 乳腺癌
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