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两种表达系统来源新冠病毒RBD蛋白免疫小鼠后的IgG抗体水平对比研究 被引量:2
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作者 胡立强 苏涛 +3 位作者 张勇 杨浩 陶怡然 陶泽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1053-1061,共9页
当前新冠肺炎疫情仍在全球蔓延,给中国及世界的公共卫生安全和经济发展带来了严峻挑战。SARS-CoV-2病毒入侵机体的关键过程是刺突蛋白受体结合域RBD通过结合宿主细胞ACE2受体实现感染,而此过程与病原快速检测、疫苗以及药物干预等主要... 当前新冠肺炎疫情仍在全球蔓延,给中国及世界的公共卫生安全和经济发展带来了严峻挑战。SARS-CoV-2病毒入侵机体的关键过程是刺突蛋白受体结合域RBD通过结合宿主细胞ACE2受体实现感染,而此过程与病原快速检测、疫苗以及药物干预等主要抗病毒策略的研究与开发密切相关。因此,本研究旨在比较哺乳细胞和昆虫细胞重组表达来源的新冠病毒刺突蛋白受体结合结构域RBD免疫小鼠后产生IgG抗体水平的变化,评估不同来源和不同剂量抗原的抗体滴度水平和持续时间,希望将有助于疫苗、药物以及病原检测等相关研究。通过SDS-PAGE和质谱技术鉴定出昆虫和哺乳动物细胞表达系统制备的bRBD和hRBD蛋白质的分子量略有差异,主要为糖基化修饰不同所致;流式细胞术检测发现,bRBD和hRBD与ACE2受体过表达细胞结合率分别为88.5%和92.7%,表明二者均具有较好的活性;利用Quick Antibody免疫佐剂通过肌肉注射对Balb/c小鼠进行免疫接种,设置10μg、20μg 2个免疫抗原的剂量,共接种2次,并在初次免疫后第2、4、6、8、12、24周从尾部取血,分离获得血清;酶联免疫吸附结果显示,10μg和20μg的bRBD和hRBD蛋白质免疫均能够快速引起小鼠的免疫反应产生IgG抗体,4~6周抗体滴度达到峰值;2种抗原均具有良好的免疫持久性。2种抗原及2个免疫剂量诱导小鼠产生的抗体滴度无明显差异;血清抗体中和试验发现,bRBD和hRBD蛋白质免疫小鼠后产生的特异性抗体,均能够抑制SARS-COV-2 Spike假病毒对ACE2阳性细胞的感染。这些结果表明,昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统生产的RBD蛋白,通过良好的佐剂接种均能快速引起机体有效的体液免疫应答,产生特异性中和抗体,有望用于各种RBD突变体抗体的制备。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 刺突蛋白 受体结合区蛋白 抗体 疫苗
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线性DNA疫苗的合成开发及免疫原性初步研究
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作者 佟莹莹 陈阳 +6 位作者 刘阳 孙杰 王华 李财新 王希良 程晋霞 杨光华 《广东化工》 2025年第2期63-65,共3页
DNA从头合成技术的高速发展促进了生物药物、病毒疫苗等研制开发。为探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)为靶抗原的线性DNA疫苗... DNA从头合成技术的高速发展促进了生物药物、病毒疫苗等研制开发。为探讨以严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)为靶抗原的线性DNA疫苗的免疫原性,本文基于DNA补丁寡核苷酸合成法(patcholigodeoxynucleotidesynthesis,POS)合成专利技术(CN200610148058.6),在体外无病毒基因模板的条件下合成启动子(cytomegalovirus,CMV)、目标抗原RBD和多聚腺苷酸(polyadenylic acid,ployA)的完整表达框序列,转染人胚肾293T细胞并验证。采用微量中和实验检测各组小鼠血清的病毒中和抗体效价;并在第二次免疫后采用攻毒保护实验检测线性DNA疫苗对各组小鼠的保护率。结果显示我们利用一步法快速合成了含RBD基因的线性DNA疫苗,优化序列的表达量高于原序列38%,免疫实验显示以RBD为靶抗原的SARS-CoV-2线性DNA疫苗能诱导一定的中和抗体,提供一定的保护性。为线性DNA疫苗的合成开发提供新的思路。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 受体结合区域(rbd) 线性DNA疫苗 免疫原性
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TGEV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达及鉴定 被引量:4
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作者 伊立超 李乐天 +6 位作者 郝嘉翼 时小双 张爽 徐鹏 任世斌 高旭 李昌 《动物医学进展》 北大核心 2021年第9期65-70,共6页
旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分... 旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白。受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素。根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分,亚克隆至杆状病毒pFastBacTMDual上,获得重组质粒,命名为pFBD-TGR。将该质粒转化DH10Bac感受态细胞中,筛选较大的白色菌落,获得重组杆状质粒Bacmid-TGR,转染至sf9细胞中进行拯救病毒,转染后5 d~7 d,收上清,传至第3代,应用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测sf9细胞上清,进行目的蛋白表达鉴定。结果显示,重组穿梭质粒Bacmid-TGR构建成功,Western blot结果证明,杆状病毒表达了TGEV-RBD蛋白且能与Strep tag抗体和抗猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光结果证明,成功地表达了TGEV-RBD蛋白,为进一步开展猪传染性胃肠炎病毒抗体研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 杆状病毒 受体结合域 蛋白表达
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新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化 被引量:3
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作者 侯江厚 张灵霞 +2 位作者 黄国红 詹晓燕 杨奕梅 《生物技术通讯》 CAS 2020年第3期292-296,共5页
目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体... 目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒S蛋白 受体结合域(rbd) 原核表达 肠激酶 纯化
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猪δ冠状病毒RBD蛋白多肽抗体的制备与鉴定
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作者 张国庆 姜宇航 +8 位作者 张爽 李乐天 郝嘉翼 陈竞 邹万成 李昌 李太元 高旭 金宁一 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1575-1583,共9页
【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位... 【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0~14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0~7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1000、1∶2000倍比稀释后均能特异性识别转染pcDNA3.1-PDR-Strep的Expi293F表达的PDCoV RBD蛋白、杆状病毒感染SF9细胞表达的PDCoV RBD蛋白,1∶1000稀释后能够检测到PDCoV感染ST细胞表达的PDCoV S蛋白,而在TGEV和PEDV感染的细胞中未检测到特异性蛋白的表达;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价可以达到1∶12800。【结论】利用生物信息学技术成功预测PDCoV RBD蛋白抗原表位,免疫后获得的抗体具有较好的特异性。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒(PDCoV) 受体结合结构域(rbd) 抗原表位 多肽抗体
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新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:5
6
作者 彭晓燕 陆盼盼 胡祖权 《生物技术进展》 2023年第1期102-106,共5页
为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载... 为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 受体结合域 原核表达 融合蛋白 多克隆抗体
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糖基化修饰对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(Spike RBD)与受体ACE2结合影响的非变性质谱研究 被引量:1
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作者 罗宇翔 黄静 李惠琳 《质谱学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期687-696,I0003,共11页
新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化... 新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化有利于理解病毒入侵的机制,为药物研发提供思路。结构质谱是蛋白质结构表征中广泛应用的方法,本工作通过非变性质谱(native MS)研究糖蛋白RBD和ACE2样品及其复合物。首先,优化了使用PNGase F切除RBD N-糖时的条件,对切糖后RBD蛋白的异质性进行分析,并进一步考察了切糖前后RBD与ACE2形成蛋白复合物的稳定性。结果表明,RBD N-糖的切除会导致其与ACE2形成的复合物稳定性降低。本工作可为RBD的N-糖基化作用分析提供参考,并为后续实验RBD是否需要切N-糖处理提供指导建议。 展开更多
关键词 新型冠状病毒肺炎(COVID-19) 刺突蛋白 受体结合区域(rbd) 血管紧张素转化酶2(ACE2) 糖蛋白 N-糖酰胺酶F 非变性质谱
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新型冠状病毒S蛋白RBD区的重组猫疱疹病毒的构建及鉴定
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作者 王凤杰 周鑫韬 +4 位作者 齐宇 韩桪 蒋依倩 陈腾 扈荣良 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第23期72-77,135,共7页
为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(E... 为了开发一种猫用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组猫疱疹病毒活载体疫苗,试验以猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-Ⅰ)为病毒载体,采用同源重组技术将亲本病毒FHV-Z的gI和gE基因替换为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合域(RBD)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP蛋白)串联表达盒;利用Overlap PCR方法构建包含RBD-EGFP串联表达盒的重组质粒pUC19-RBD-EGFP,并用该重组质粒与FHV-Z基因组共同转染F81细胞,通过有限稀释法和绿色荧光病变灶筛选完成重组病毒rFHV-RBD的纯化;经PCR、测序、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot方法分析重组病毒rFHV-RBD;用1×10^(7.0)TCID_(50)/mL的重组病毒rFHV-RBD滴鼻免疫猫,利用ELISA方法监测免疫后第0,7,14,21天猫体内特异性抗RBD抗体变化情况。结果表明:试验成功拯救了重组病毒rFHV-RBD,该重组病毒连续传代15代仍能检测到RBD-EGFP串联表达盒,遗传稳定性较好,重组病毒rFHV-RBD的生长特性与亲本病毒FHV-Z无明显差异,能够在重组病毒感染的F81细胞中正确表达S-RBD蛋白,滴鼻免疫猫后第21天特异性抗RBD抗体极显著升高(P<0.01)。说明试验获得的重组病毒rFHV-RBD具有良好的免疫原性,可用于开展猫新型冠状病毒肺炎疫苗的研究。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 刺突蛋白 受体结合域 猫疱疹病毒Ⅰ型 免疫原性
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SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定
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作者 陈秀婷 汪毅祯 +2 位作者 商慧娴 王思令 郑子峥 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期693-697,共5页
目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋... 目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白;冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域(RBD)上的关键氨基酸位点;间接ELISA与表面等离子共振(SPR)技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力;采用基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果:本研究发现XMA09识别的表位较为保守,对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力,能广谱中和关切突变株(VOCs),包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论:XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体,具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力,并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 受体结合结构域(rbd) 广谱中和抗体
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SARS冠状病毒S蛋白受体结合域的克隆测序
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作者 高俊 肖洪广 林勇平 《广州医药》 2006年第5期49-52,共4页
目的从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆。方法用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列。结果获得了人和果子狸来源的RBD... 目的从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆。方法用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列。结果获得了人和果子狸来源的RBD的基因片段,长度为579 bp,两者具有高度的同源性。结果RBD是SARS冠状病毒与靶细胞结合的部位,本工作成功克隆了SARS冠状病毒的RBD基因,为该基因的表达和功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒 受体结合域 克隆 测序
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信号肽对SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响 被引量:1
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作者 吴清胜 李媛媛 姚春萍 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第3期280-286,共7页
目的比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按... 目的比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组。通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库。将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×10^(6)个/mL)和对数生长中期细胞(1.2×10^(7)个/mL)。将各组病毒培养至100 mL(500 mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测。S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证。结果B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异。A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag)。分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高。结论S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽。表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关。 展开更多
关键词 信号肽 分泌表达 SARS-CoV-2 S1蛋白 受体结合域 杆状病毒-昆虫细胞系统
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Therapeutic Implications of Monoclonal Antibody
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作者 Mohammad Shane Alam Farhana Riyaz Shah +3 位作者 Muntser Mohammad Fadoul Alhassen Saif Elden B. Abdalla Abdul Mateen Md. Shakir Ahmad 《Journal of Biosciences and Medicines》 CAS 2023年第3期85-104,共20页
Background: The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic is a distinct public health issue that calls for the quick development of novel treatments and viral detection. Due to their high specificity and reliabilit... Background: The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic is a distinct public health issue that calls for the quick development of novel treatments and viral detection. Due to their high specificity and reliability, monoclonal antibodies (mAbs) have emerged as useful diagnostic and therapeutic tools for a variety of diseases. As a result, several scientists have jumped right into developing Ab-based assays for the identification of SARS-CoV-2 and Ab drugs for use as COVID-19 therapy agents. Since the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike protein is essential for viral infection and has a known precise structure, it has become a key target for the creation of therapeutic antibodies. The use of Ab cocktails is anticipated to be a key component of an efficient COVID-19 treatment plan since SARS-CoV-2 is an RNA virus with a high mutation rate, particularly when subjected to the selection pressure of aggressively applied preventive vaccinations and neutralizing Abs. Furthermore, SARS-CoV-2 infection could provoke an overzealous immune response, leading to a cytokine storm that accelerates the onset of a severe disease. Abs to counteract cytokine storms are also actively being researched as COVID-19 therapies. Abs are now used in SARS-CoV-2 detection assays, including immunoglobulin and antigen tests, in addition to their use as medicines. In order to stop the spread of COVID-19, such Ab-based detection tests are essential surveillance tools. In this article, we’ll go over several important ideas related to mAb-based COVID-19 pandemic detection tests and treatments. Objective: To understand the role of hybridoma technology in therapeutic implications. 1) To study the basic concepts and options in hybridoma technology;2) To study the applications of hybridoma technology;3) To explore how hybridoma technology is applied in diagnostic histopathology. Method: For this method generally there is use of mouse or mammals are transfect with the Ags to find out the formation of antibody afterwards isolate the antibody which has been formed after injecting the antigens for a number of weeks. Following are the steps for mAbs: Step 1: In this step immunization of mouse is done;Step 2: Spleen is used for the isolation of B cells;Step 3: Cultivation of cancerous cells;Step 4: Merging of B cells with Myeloma cells;Step 5: This step cell lines are separated;Step 6: in the next step screening the suitable cell lines;Step 7: observation of multiplication in vitro as well as in vivo;Step 8: Harvesting. Discussion: Now a day there are many diseases which has been cured easily at the mean time it’s very difficult to diagnose and get the treatment. Due to advancement of monoclonal antibodies are used in the diagnosis and treatments such as COVID-19, SARS and SARS COV-2. Therefore important part of the monoclonal antibodies are its used in the diagnosis as well as in the treatment tools. 展开更多
关键词 Monoclonal Antibody Cancerous Cell receptor-binding Domain (rbd) Immune System SARS-CoV-2 and COVID-19
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基于受体结合区(RBD)的ELISA在MERS-CoV抗体检测中的应用评价 被引量:2
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作者 王文玲 杨韧 +4 位作者 宋倩倩 王慧娟 邓瑶 赵莉 谭文杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期763-770,共8页
目的比较中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不同形式受体结合区(receptor binding domain,RBD)蛋白在抗体检测中的应用特点.方法以293T和ExpiCHO-STM系统表达并纯化制备MERS-CoV RBD,采... 目的比较中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不同形式受体结合区(receptor binding domain,RBD)蛋白在抗体检测中的应用特点.方法以293T和ExpiCHO-STM系统表达并纯化制备MERS-CoV RBD,采用非变性凝胶电泳和Western blot对纯化RBD蛋白进行鉴定.然后以等量的上述RBD蛋白或昆虫细胞表达的RBD作为包被抗原,建立间接酶联免疫检测方法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA),用于MERS-CoV IgG抗体检测.同时以商品化的欧蒙MERS-CoV IgG抗体检测试剂盒(以S1为包被抗原)为对照,利用WHO提供的MERS-CoV抗体参比品对基于不同RBD蛋白抗原的ELISA方法进行应用效果比较分析.结果采用293T和ExpiCHO-STM系统成功制备MERS-CoV RBD单体/聚体抗原;不同来源与形式的RBD抗原均能特异识别MERS-CoV特异抗体,与正常成人血清无交叉反应;基于RBD所建立的ELISA应用于MERS-CoV抗体参比品检测,与欧蒙商品化试剂盒检测结果具有较好的一致性,但RBD-T4f、RBD-GCN4聚体RBD检测阳性标本的读值高且较集中,单体/二聚体RBD(昆虫细胞或哺乳动物细胞)阳性标本的读值低且较分散.结论建立了基于MERS-CoV不同单体与聚体RBD蛋白抗原的间接ELISA检测方法,可替代欧蒙商品化试剂盒用于临床检测MERS-CoV特异IgG抗体.RBD-T4f、RBD-GCN4包被抗原的应用结果优于RBD抗原. 展开更多
关键词 中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV) 受体结合区(rbd) 抗体 酶联免疫吸附试验(ELISA)
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PEDV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量:3
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作者 伊立超 李乐天 +6 位作者 郝嘉翼 时小双 张爽 高子函 金宁一 娄安钢 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1710-1715,1733,共7页
受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(Gen... 受体结合域是决定病毒侵入宿主及其嗜性的关键因素。该研究目的在于获得具有天然构象且反应原性良好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的受体结合域(receptor-binding domain,RBD)蛋白。根据PEDV S蛋白序列(GenBank登录号:AKN45969.1),设计、优化并合成其RBD部分基因序列,并将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual上,得到了重组质粒pFBD-PER。将pFBD-PER转化到大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid-PER,通过脂质体转染至Sf9细胞中进行病毒拯救。转染120 h后,收取上清病毒液,盲传3代后收取Sf9细胞,利用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot确定PEDV-RBD蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-PER酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PER成功构建,杆状病毒能够表达PEDV-RBD蛋白,且能与strep tag抗体发生特异性反应。IFA鉴定出现特异性绿色荧光。结果表明,成功表达了PEDV-RBD蛋白且具有反应原性,为深入开展PEDV抗体制备、新型疫苗研发奠定基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 杆状病毒 受体结合域 蛋白表达
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功能性新型冠状病毒RBD结构域在毕赤酵母表面的展示
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作者 于璐 胡暄 +2 位作者 张小鹃 牛安娜 张晓鹏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期30-38,共9页
目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RB... 目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能。结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70%;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(K_(D)=30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(K=16.00 nmol/L)较为接近。结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价。 展开更多
关键词 表面展示 新型冠状病毒 毕赤酵母 受体结合结构域 亲和力
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SARS-CoV-2亚单位疫苗制备及免疫原性初步研究
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作者 徐骁 黄涛 +6 位作者 刘铁柱 芜为 孙丽娜 李川 李建东 王世文 王希良 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期943-951,共9页
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)自2019年年末出现以来,给全人类造成了严重的公共卫生事件和社会经济负担。本实验以SARS-CoV-2突变株XBB1.5的受体结合域(Receptor bindin... 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)自2019年年末出现以来,给全人类造成了严重的公共卫生事件和社会经济负担。本实验以SARS-CoV-2突变株XBB1.5的受体结合域(Receptor binding domain,RBD)序列为疫苗核心分子串联SARS-CoV-2的全长S蛋白制备了亚单位纳米颗粒疫苗。将S蛋白的6个氨基酸残基突变为6个脯氨酸残基,提高表达量和蛋白质分子的稳定性。而且将弗林酶酶切位点进行突变以增加蛋白质的稳定性。在羧基端串联昆虫铁蛋白的氨基酸序列,利用铁蛋白纳米颗粒多面体可结合抗原蛋白的特性,增加抗原递呈。在氢氧化铝和CpG1018双佐剂组合免疫小鼠后,可诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2多种变异株的中和抗体,且可诱导小鼠产生了较强的细胞免疫和体液免疫。本研究表明,XBB1.5突变株RBD区域串联S蛋白全长序列及昆虫铁蛋白制备的纳米颗粒疫苗可以有效预防SARS-CoV-2变体,是一个很好的候选疫苗分子。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 亚单位疫苗 受体结合域 血管紧张素转化酶2
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新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域二聚体纯度检测方法的建立及验证
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作者 段艳 李文东 +2 位作者 李珉 何欢 李潇 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第10期1239-1244,1250,共7页
目的建立应用生物分析仪(Agilent 2100)检测新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域(receptor-binding domain,RBD)二聚体纯度的方法,并对其进行验证。方法对新型冠状病毒重组蛋白疫苗进行解析附后,超滤浓缩蛋白,采用生物分析仪(Agilent ... 目的建立应用生物分析仪(Agilent 2100)检测新型冠状病毒重组蛋白疫苗中受体结合域(receptor-binding domain,RBD)二聚体纯度的方法,并对其进行验证。方法对新型冠状病毒重组蛋白疫苗进行解析附后,超滤浓缩蛋白,采用生物分析仪(Agilent 2100)检测完全及非完全变性(二硫键保留)蛋白的纯度;对建立的方法进行系统适用性、专属性、重复性、中间精密度和准确度验证后,用其检测厂家A 4批样品。结果系统适用性验证中,8个峰均可清晰区分基线;空白溶剂在目标成分出峰位置无干扰,专属性良好;在非完全和完全变性条件下,2名实验员12次重复检测结果的RSD均小于1%,重复性和中间精密度良好;3种不同蛋白浓度(50%、80%和100%)主峰(1+2)及主峰面积占比的RSD分别为0.68%和0.31%,准确度良好,其中,10%蛋白浓度样品结果不稳定;4批样品RBD二聚体纯度分别为70.5%、70.2%、73.2%和69.6%。结论建立的方法专属性、精密度、准确度良好,可用于重组蛋白疫苗中蛋白纯度的检测。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 重组蛋白疫苗 受体结合域 二聚体 蛋白纯度
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基于刺突糖蛋白受体结合区的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证
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作者 李静静 刘晓雅 +2 位作者 程英杰 吴常伟 黄恩启 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第12期1484-1489,1494,共7页
目的 建立基于刺突糖蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD)的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体(CB6-HRP)为检测抗... 目的 建立基于刺突糖蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD)的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体(CB6-HRP)为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,确定GH4(500、1 000、2 000 ng/mL)及CB6-HRP(3.906 25~500 ng/mL)的工作浓度,并对方法进行线性范围、准确性、精密性、专属性和耐用性验证。采用建立的方法检测3批重组SARS-CoV-2疫苗(CHO细胞)原液的抗原含量。结果 GH4及CB6-HRP的工作浓度分别为1 000和31.25 ng/mL。原液参比品在0.488~125 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系,R~2均> 0.99;准确性验证的回收率在87.2%~120.5%之间;重复性和中间精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20.0%;专属性验证的错误率在-16.6%~2.1%之间;耐用性验证的RSD均<20.0%。3批疫苗原液抗原含量分别为638.9、592.4、664.8 ng/mL,RSD为5.8%。结论 建立的基于S蛋白RBD的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性,可用于重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的检测,为该疫苗的质量控制奠定了基础。 展开更多
关键词 重组SARS-CoV-2疫苗 刺突糖蛋白 受体结合区 双抗体夹心ELISA法 抗原含量
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2受体结合域蛋白的分泌表达及其免疫原性分析
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作者 童光伟 赵大鹏 +3 位作者 刘丽 高宁 尹金良 卢颖林 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第8期911-916,931,共7页
目的原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARSCoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路... 目的原核可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARSCoV-2)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,纯化后免疫小鼠,检测其免疫原性,为SARS-CoV-2候选疫苗的制备提供新的思路。方法扩增SARS-CoV-2 RBD蛋白基因片段,酶切后与pNCMO2表达载体连接,构建重组表达质粒pNC-RBD。将重组原核表达质粒转化入短小芽孢杆菌感受态细胞,扩大培养并降温诱导蛋白表达。利用亲和层析纯化目的蛋白,经氢氧化铝佐剂吸附后经背部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,以仅免疫铝佐剂为对照,每组10只。ELISA法检测体液免疫效果,体外增殖试验测定细胞免疫效果,ELISA法测定多种细胞因子的体外分泌,流式细胞术测定细胞分型。结果重组表达质粒pNC-RBD经菌落PCR及测序证明构建正确。重组蛋白相对分子质量约22000,可分泌表达。纯化后重组蛋白纯度达95%以上。免疫小鼠后血清结合抗体和中和抗体效价分别可达1∶10000和1:750左右,均显著高于佐剂组(t分别为2.845和2.528,P均<0.01);体外可刺激淋巴细胞增殖,并促进IL-1β及IFNγ的分泌;细胞分型试验结果表明促进了CD4~+和CD8~+T细胞淋巴细胞增殖。结论成功可溶性表达了SARS-CoV-2 RBD蛋白,其免疫原性良好,为以RBD蛋白为基础研制SARS-CoV-2基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 受体结合域蛋白 可溶性表达 免疫原性
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冠状病毒单克隆抗体治疗药物相关专利浅析 被引量:1
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作者 张彬 滕文静 +2 位作者 钟辉 曹扣 张须龙 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第34期3979-3983,共5页
冠状病毒,如SARS-CoV、MERS-CoV以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的流行严重威胁了人类生命健康并造成了重大社会经济损失.本文主要针对冠状病毒单克隆抗体药物的专利申请布局和临床试验成果进行分析.专利申请方面,诊断性冠状病毒单克隆抗... 冠状病毒,如SARS-CoV、MERS-CoV以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的流行严重威胁了人类生命健康并造成了重大社会经济损失.本文主要针对冠状病毒单克隆抗体药物的专利申请布局和临床试验成果进行分析.专利申请方面,诊断性冠状病毒单克隆抗体专利申请的比例高于治疗性单克隆抗体,治疗性单克隆抗体专利申请以产品类为主,作用靶点主要集中在S蛋白或其受体结合区;中国专利申请的比重小于国外专利申请,中国专利以高校和科研院所为主要申请主体.临床研究成果方面,用于治疗MERS-CoV的单克隆抗体药物尚处于临床试验阶段,通过特异靶向MERS-CoV的S蛋白来阻断病毒感染细胞;未追踪到针对新型冠状病毒单克隆抗体药物的临床研究.由于新型冠状病毒的受体结合区与SARS-CoV存在交叉的表位肽,通过验证抗SARS-CoV的单克隆抗体用于治疗新型冠状病毒的效果,进而布局应用于抗新型冠状病毒的单克隆抗体的用途专利申请.针对新型冠状病毒受体结合区的阻断性单克隆抗体可作为治疗新型冠状病毒的潜在药物,相关专利申请和药物研发也将是未来的热点. 展开更多
关键词 SARS-COV MERS-CoV SARS-CoV-2 新型冠状病毒 刺突蛋白 受体结合区
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