人纤溶酶原Kringle 5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定 被引量：3

1

作者 陈浩 陈于红 +2 位作者 张菁 刘建宁 朱德煦 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期218-222,共5页

根据人纤溶酶原的cDNA序列 ,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle 5结构域的基因 ,并将其克隆至表达质粒 pET2 5b(+)中 .重组载体 pET2 5b(+) /kringle 5转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,在 12kD处可见明显的表达条带 ,表达... 根据人纤溶酶原的cDNA序列 ,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle 5结构域的基因 ,并将其克隆至表达质粒 pET2 5b(+)中 .重组载体 pET2 5b(+) /kringle 5转化至大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导表达 ,在 12kD处可见明显的表达条带 ,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在 .包涵体经过体外变复性 ,SP SepharoseFF离子交换柱一步纯化 ,15%SDS PAGE鉴定考染一条带 ,纯度达 95%以上 .所得到的目标蛋白能明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生 . 展开更多

关键词 血管生成抑制素 kringle5 包涵体 人纤溶酶原基因 克隆 表达 纯化 鉴定 肿瘤治疗

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人膀胱癌组织Kringle 5基因的克隆、优化表达、纯化及活性鉴定 被引量：1

2

作者 柯昌兴 王剑松 +5 位作者 胡明宇 毕城伟 陈慧诚 刘龙丁 颜汝平 詹辉 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期1656-1659,共4页

目的构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性。方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白。带谷胱甘... 目的构建能够表达分泌性人纤溶酶原krinle5(K5)的大肠杆菌工程菌,优化表达并鉴定其抗人血管内皮细胞(ECV)304的生物活性。方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增K5基因,构建原核表达载体pGEX-5X-1/K5,运用工程菌表达蛋白。带谷胱甘肽(GST)标签琼脂糖4B亲和柱层析、纯化蛋白,CellTiter96AQueous细胞增殖检测法(MTS)检测K5对ECV304增殖影响。结果 PCR扩增得到282bp片段,并成功插入pGEX-5X-1质粒,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下工程菌表达了特异性融合蛋白,经凝血酶酶切后得到分子量约为12kD的K5蛋白;K5蛋白能特异性抑制ECV304增殖,抑制率最高蛋白浓度为5ng/L。结论含重组质粒pGEX-5X-1/K5大肠杆菌表达产物量多且易纯化,为包括肿瘤在内的病理性血管增生疾病抗血管生成药物开发做了积极的尝试。 展开更多

关键词 纤溶酶原 kringle5基因 融合蛋白 基因

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基因重组纤溶酶原Kringle 5对血管生成抑制作用的研究

3

作者 董晓婷 杨健 +1 位作者 白佳琨 边六交 《医学分子生物学杂志》 CAS 2022年第3期187-191,共5页

目的研究基因重组纤溶酶原(Kringle 5,K5)对小鼠的血管生成的抑制作用。方法以体外培养的小鼠内皮细胞为研究对象,利用划痕实验和黏附能力测定实验观察重组K5对内皮细胞迁移、黏附能力的影响;利用体外血管生成体系、创伤愈合和鸡胚尿囊... 目的研究基因重组纤溶酶原(Kringle 5,K5)对小鼠的血管生成的抑制作用。方法以体外培养的小鼠内皮细胞为研究对象,利用划痕实验和黏附能力测定实验观察重组K5对内皮细胞迁移、黏附能力的影响;利用体外血管生成体系、创伤愈合和鸡胚尿囊膜(chicken embryo allantoic membrane,CAM)血管生成能力实验,检测K5对血管生成作用的影响。结果200 nmol/L K5显著抑制内皮细胞的迁移、黏附以及新生血管的生长长度。并且K5在2~18 mg/kg浓度范围内对小鼠创伤愈合具有明显的抑制作用。此外,6、12与25 mg/L K5显著抑制CAM血管生成,25 mg/L K5的抑制作用最强。结论K5能明显抑制血管生成,为临床抑制血管生成治疗提供理论依据。 展开更多

关键词 人纤溶酶原kringle 5 内皮细胞 血管生成

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可溶型非融合血管生长抑制因子Kringle 5基因工程菌发酵培养和诱导表达条件的优化 被引量：1

4

作者 马晓娟 蔚萍 +1 位作者 妙亮 边六交 《化学与生物工程》 CAS 2012年第4期27-31,共5页

在实验室试管培养条件下优化了基因工程菌E.coli BL21(DE3)pET15b/K5发酵产可溶型非融合血管生长抑制因子Kringle 5的培养基和诱导表达条件。经菌体干重测定和SDS-PAGE检测,确定最佳培养基(g.L-1)为:胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10... 在实验室试管培养条件下优化了基因工程菌E.coli BL21(DE3)pET15b/K5发酵产可溶型非融合血管生长抑制因子Kringle 5的培养基和诱导表达条件。经菌体干重测定和SDS-PAGE检测,确定最佳培养基(g.L-1)为:胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,葡萄糖6.0,NH4Cl 2.6,NaH2PO45.0,Na2HPO46.0;优化的诱导表达条件为:诱导剂浓度0.01mmol.L-1,诱导时间6h,诱导温度37℃,摇床转速220r.min-1。在优化的培养基和诱导表达条件下,菌体干重为1.8g.L-1,Kringle 5表达量为360mg.L-1,占总蛋白含量的20%,与基础LB培养基相比,Krin-gle 5表达量提高了1.18倍。 展开更多

关键词 血管生长抑制因子kringle5 发酵培养基 诱导表达 基因工程菌 优化

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重组人kringle 5蛋白滴眼液抑制兔角膜新生血管的研究 被引量：19

5

作者 刘祖国 张志红 +6 位作者 马建兴 张梅 罗丽辉 肖启国 林健贤 张平 陈家祺 《中华眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第7期415-418,I007-005,共5页

目的　观察重组人kringle 5 (K 5蛋白 )滴眼液抑制碱烧伤诱导的兔角膜新生血管(neovascularization ,NV)的效果 ,探讨其作用机制。方法　采用基因重组方法获得K 5蛋白 ,取新西兰白兔 4 0只 ,将浸有 1mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔角膜中央 ... 目的　观察重组人kringle 5 (K 5蛋白 )滴眼液抑制碱烧伤诱导的兔角膜新生血管(neovascularization ,NV)的效果 ,探讨其作用机制。方法　采用基因重组方法获得K 5蛋白 ,取新西兰白兔 4 0只 ,将浸有 1mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔角膜中央 ,制成碱烧伤模型 ,随机均分为A、B、C及D组 ,每组 10只兔 (10只眼 ) ,伤后即分别滴用 5、10及 2 0mg/L的K 5蛋白滴眼液 ,对照 (D)组滴载体溶液 ;均每日 4次 ,共滴 2 8d。裂隙灯显微镜下观察角膜NV生长情况 ,并计算其面积 ,伤后 2 8d处死实验兔 (A、B及C组 ) ,取其角膜片做组织病理学检查。结果　伤后A、B、C及D组角膜NV开始出现的时间分别为 (3 4± 0 5 )d、(6 8± 0 4 )d、(6 7± 0 7)d及 (3 7± 0 5 )d ,其中B组明显较D组延长(P <0 0 5 ) ,而A组与D组间差异无显著意义 (P >0 0 5 )。伤后各时间点B及C组角膜NV的生长面积均明显较D组减少 (P <0 0 5 ) ,B与C组角膜NV区面积间比较 ,差异无显著意义 (P >0 0 5 )。角膜组织病理学检查 ,D组烧伤区可见大量炎性细胞浸润及角膜NV形成 ,而B及C组角膜炎性反应较轻 ,烧伤区无NV形成。角膜NV区面积与角膜后膜和炎性细胞数均有明显相关性 (P <0 0 5 )。结论重组人K 5蛋白滴眼液可明显抑制碱烧伤引起的角膜NV的生长 。 展开更多

关键词 重组人kringle5蛋白滴眼液 角膜新生血管 化学烧伤

原文传递

抗菌肽Cecropin B—肿瘤血管生长抑制因子Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达 被引量：4

6

作者 樊钰虎 冯瑄 +1 位作者 杨晓燕 边六交 《药物生物技术》 CAS CSCD 2005年第5期281-284,290,共5页

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(... 通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。 展开更多

关键词 抗菌肽CECROPIN B 肿瘤血管生长抑制因子kringle5 重叠区扩增法 融合表达载体

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纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究 被引量：6

7

作者 马建芳 杨中汉 +7 位作者 李朝阳 蔡卫斌 宋志宏 郭颖 郭琳琅 李民友 刘祖国 高国全 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第12期1245-1248,共4页

目的纤溶酶原蛋白水解片段Kringle 5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值,但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mut1)并检测其体外活性。方法除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以... 目的纤溶酶原蛋白水解片段Kringle 5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值,但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mut1)并检测其体外活性。方法除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量,但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,获得突变型K5 Mut1 (Cys1-80);MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果K5 Mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞,EC50(抑制50%细胞增生的药物浓度)约为35 nmol/L,是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内,K5 Mut1并不抑制同源的周皮细胞,表明K5 Mut1特异性抑制血管内皮细胞增生。结论K5 Mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。 展开更多

关键词 纤溶酶原缺失 血管内皮细胞增生 纤溶酶原蛋白水解片段 血管增生性疾病 突变型kringle5

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纤溶酶原Kringle5的抑制血管增生作用 被引量：4

8

作者 蔡卫斌 刘倩平 高国全 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期159-162,共4页

纤溶酶原Kringle 5是纤溶酶原中与血管抑素相连的另一个联环结构域 ,它能抑制内皮细胞的增殖、迁移 ,并能诱导内皮细胞凋亡和细胞周期停滞 ,具有很强的抑制血管生成活性 ,是抑制活性最强的纤溶酶原水解片段。同时它具有分子量小、性质... 纤溶酶原Kringle 5是纤溶酶原中与血管抑素相连的另一个联环结构域 ,它能抑制内皮细胞的增殖、迁移 ,并能诱导内皮细胞凋亡和细胞周期停滞 ,具有很强的抑制血管生成活性 ,是抑制活性最强的纤溶酶原水解片段。同时它具有分子量小、性质稳定、毒副作用小、特异性高等优点 。 展开更多

关键词 纤溶酶原 kringle5 血管增生 内皮细胞 细胞凋亡

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重组人纤溶酶原Kringle5的标记及其肿瘤显像 被引量：3

9

作者 李彪 赵龙 +3 位作者 张一帆 尹桂芝 张志勇 朱承谟 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第12期1218-1220,共3页

目的探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5(K5)用于肿瘤显像的可行性。方法采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5(rhK5),以Iodogen法制备^(125)I-rhK5和^(131)I-rhK5,进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究。结果^(125)I-rhK5和^(13... 目的探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5(K5)用于肿瘤显像的可行性。方法采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5(rhK5),以Iodogen法制备^(125)I-rhK5和^(131)I-rhK5,进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究。结果^(125)I-rhK5和^(131)I-rhK5的标记率为86%和84%,放化纯度为96%和95%。竞争结合实验表明,rhK5标记后其生物活性没有改变;荷瘤裸鼠体内分布显示,12h肿瘤肌肉组织比可达4.94±0.89;^(131)I-rhK5肿瘤显像示肿瘤部位放射性浓聚随时间逐渐增加,3h可见肿瘤清晰显影。结论Iodogen法制备^(125)I-rhK5和^(131)I-rhK5纯度高、稳定性好。^(131)I-rhK5可进行肿瘤的显像,为肿瘤的显像和治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 kringle5 肿瘤 新生血管 放射性核素显像

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重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响 被引量：1

10

作者 宋哲 黎晓新 +2 位作者 于文贞 董建强 闫征 《国际眼科杂志》 CAS 2007年第2期380-382,共3页

目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠... 目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养;按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组;聚合酶链反应(PCR),MTT法对各组进行细胞活力测定;荧光显微镜照相。结果:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用,实验组与对照组比较P<0.01,实验组与空白对照组比较P>0.05;腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响,实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P>0.05。结论:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。 展开更多

关键词 腺伴随病毒载体 血管抑制素kringle5 血管内皮细胞 SD大鼠视网膜神经细胞

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人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中的表达 被引量：1

11

作者 陈广南 罗进贤 +1 位作者 卢文菊 张添元 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1999年第6期62-66,共5页

将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形... 将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白的528%. 展开更多

关键词 人纤溶酶原 kringle5功能区 基因表达 大肠杆菌

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基因重组Kringle 5蛋白遗传毒性试验研究 被引量：1

12

作者 陈显久 解军 +1 位作者 张悦红 牛勃 《职业与健康》 CAS 2011年第3期273-275,共3页

目的检测基因重组Kringle 5蛋白的遗传毒性,为其临床应用提供医学毒理学依据。方法采用国内外遗传毒性试验指导原则推荐的标准组合中Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验检测基因重组Kringle 5蛋白的致突变作用... 目的检测基因重组Kringle 5蛋白的遗传毒性,为其临床应用提供医学毒理学依据。方法采用国内外遗传毒性试验指导原则推荐的标准组合中Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验检测基因重组Kringle 5蛋白的致突变作用。结果 Ames试验中,Kringle 5蛋白各组回变菌落数均未超过自发回变菌落数2倍,且无剂量-反应关系,故Ames试验结果为阴性,说明Kringle 5蛋白对鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100和TA102 4个菌株均未呈现遗传毒性。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验中,Kringle 5蛋白各剂量组雌雄性别微核形成率与阴性对照结果比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明该Kringle 5蛋白骨髓微核试验结果为阴性。小鼠精子畸形试验中,各实验组与阴性对照组结果比较,差异无统计学意义(P>0.05),表明该Kringle 5蛋白精子畸形试验结果为阴性。结论基因重组Kringle 5蛋白无遗传毒性。 展开更多

关键词 kringle5 AMES试验 微核试验 精子畸形试验

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核酸适配体对纤溶酶原Kringle 5抗血管生成功能的影响

13

作者 段美娇 周雅琪 +1 位作者 王翠玲 边六交 《中国现代应用药学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第21期2909-2916,共8页

目的研究核酸适配体K-a2ct与纤溶酶原Kringle 5(K5)的特异性结合对K5抑制血管内皮细胞增殖和迁移以及促进血管内皮细胞凋亡功能的影响。方法利用原核系统对重组K5蛋白进行克隆和表达,并采用亲和层析法对表达的K5蛋白进行分离纯化;使用... 目的研究核酸适配体K-a2ct与纤溶酶原Kringle 5(K5)的特异性结合对K5抑制血管内皮细胞增殖和迁移以及促进血管内皮细胞凋亡功能的影响。方法利用原核系统对重组K5蛋白进行克隆和表达,并采用亲和层析法对表达的K5蛋白进行分离纯化;使用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)和酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide adsorption assay,ELONA)对K-a2ct与K5的亲和特异性进行验证;采用CCK-8、细胞划痕试验观察K-a2ct对K5抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖和迁移功能的影响;采用激光共聚焦显微镜观察Hoechst 33342染色的HUVEC细胞凋亡形态,并采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测K-a2ct对K5促进HUVEC细胞凋亡功能的影响。结果重组蛋白K5在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化的重组K5相对分子质量为12 kDa,浓度为0.32 mg·mL^(−1);ITC、ELONA结果显示K-a2ct对K5的亲和性强,且具有良好的选择性,具备典型核酸适配体的亲和特异性;CCK-8、细胞划痕试验结果表明,K-a2ct能够抑制K5的抗血管内皮细胞增殖和迁移的作用,且抑制程度与K-a2ct呈剂量依赖关系;激光共聚焦和流式细胞术结果表明,K-a2ct对K5促HUVEC细胞凋亡的功能有一定抑制作用,且主要影响K5作用的HUVEC细胞晚期凋亡,对早期凋亡影响不大。结论核酸适配体K-a2ct以高亲和力和特异性结合K5,并以剂量依赖性方式抑制K5的抗血管生成功能,在靶向调节K5在体内的浓度和功能以及促进血管新生方面具有很大潜力。 展开更多

关键词 核酸适配体 纤溶酶原kringle 5 特异性结合 细胞凋亡 血管生成

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Kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建 被引量：1

14

作者 郑合明 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2002年第2期156-159,共4页

目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结... 目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结果 :得到的kringle 5基因序列测定结果与文献相符 ,重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确 ,含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论 :重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制 。 展开更多

关键词 血管抑素 kringle5基因 穿梭表达载体 反转录PCR 启动子CaMV35S 真核植物细胞

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Kringle5基因的克隆、原核表达载体构建和蛋白表达 被引量：1

15

作者 毕城伟 柯昌兴 +3 位作者 王剑松 胡明宇 管莹 刘龙丁 《昆明医学院学报》 2010年第1期32-35,共4页

目的寻求一条高效且快速获得kingle5蛋白的途径.方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出kringle5基因,构建出原核表达载体pGEX-5X-1/kringle5,运用工程菌表达蛋白.结果测序表明kringle5基因与GenBank上报道的基因序列相同,并成... 目的寻求一条高效且快速获得kingle5蛋白的途径.方法从人膀胱癌组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出kringle5基因,构建出原核表达载体pGEX-5X-1/kringle5,运用工程菌表达蛋白.结果测序表明kringle5基因与GenBank上报道的基因序列相同,并成功表达出kringle5融合蛋白.结论成功构建了人原核表达载体(pGEX-5X-1/kringle5),为获得抗肿瘤药物kringle5提供了一种切实可行的途径,为实体瘤的抗血管生成治疗研究奠定了初步基础. 展开更多

关键词 kringle5 RT—PCR 原核表达载体 融合蛋白

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纤溶酶原Kringle 5与层粘连蛋白α3链G1结构域间的结合及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响

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作者 张嘉昕 张椰莉 +1 位作者 宋思慧 边六交 《中华实验外科杂志》 CAS 北大核心 2022年第11期2113-2116,共4页

目的探究层粘连蛋白α3链G1结构域(LG1)是否为人纤溶酶原Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法利用蛋白印记覆膜法(Blot overlay)及酶联免疫吸附试验(ELISA)技术考察重组Kringle 5与LG... 目的探究层粘连蛋白α3链G1结构域(LG1)是否为人纤溶酶原Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法利用蛋白印记覆膜法(Blot overlay)及酶联免疫吸附试验(ELISA)技术考察重组Kringle 5与LG1间的结合能力;以紫杉醇作为阳性对照,不同浓度Kringle 5处理HUVEC;此外引入抗层粘连蛋白α3链抗体(抗LAMA3)并分成Kringle 5组(KR)、抗LAMA3+Kringle 5组(ALK)和Control组,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验考察各组中内皮细胞的增殖和凋亡,组间比较采用单因素方差分析。结果Kringle 5可剂量依赖性地特异结合LG1,平衡解离常数为12.9×10^(-8) mol/L;细胞增殖实验中的Kringle 5处理组(180、260、340、420、500×10^(-9) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.59±0.03、0.48±0.02、0.36±0.04、0.25±0.01、0.25±0.01比0.72±0.01,F=52.211、340.650、187.178、3035.236、4044.002,P<0.05),且Kringle 5组(340、420、500×10^(-9) mol/L)的增殖抑制率高于紫杉醇组[(67.85±7.07)%、(87.15±2.28)%、(87.95±1.72)%比(48.04±7.84)%,F=10.561、68.783、74.115,P<0.05];细胞凋亡实验中,Kringle 5处理组(0.32、0.64、0.96、1.28、1.60、1.92×10^(-6) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.47±0.03、0.45±0.02、0.40±0.04、0.30±0.03、0.28±0.03、0.26±0.01比0.59±0.04,F=14.122、22.986、28.333、111.968、112.113、184.012,P<0.05);KR组的增殖抑制率高于ALK组[(29.95±2.85)%、(43.60±0.23)%、(55.61±3.87)%比(-11.28±4.46)%、(-22.30±16.19)%、(-18.42±17.82)%,F=181.953、49.667、49.438,P<0.05],KR组的细胞存活率低于ALK组[(93.80±19.17)%、(53.79±1.10)%、(47.10±13.90)%比(139.97±26.99)%、(150.41±33.67)%、(115.08±30.04)%,F=5.837、24.689、12.649,P<0.05]。结论层粘连蛋白α3链为Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对HUVEC的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。 展开更多

关键词 人纤溶酶原kringle 5 层粘连蛋白α3链G1结构域 特异性结合 血管内皮细胞 增殖和凋亡

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重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

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作者 尹桂芝 李彪 +4 位作者 尤蓓 陆林 张一帆 赵龙 于金德 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2004年第1期1-4,共4页

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印... 目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。 展开更多

关键词 重组纤溶酶原kringle5区基因 杆状病毒载体 基因表达 肌细胞 检测

原文传递

血管新生抑制剂Kringle5结构及改造研究进展

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作者 陈显久 牛勃 赵荣瑞 《中国药物与临床》 CAS 2010年第12期1325-1327,共3页

Kringle5是血浆纤维蛋白溶酶原（plasminogen,Pgn）的第5个饼环区结构（kringle domain）,在体外具有抑制内皮细胞增殖,抑制内皮细胞迁移的生物学活性，在体内可抑制多种血管新生模型的新生血管形成（angiogenesis），甚至可抑制肿瘤的... Kringle5是血浆纤维蛋白溶酶原（plasminogen,Pgn）的第5个饼环区结构（kringle domain）,在体外具有抑制内皮细胞增殖,抑制内皮细胞迁移的生物学活性，在体内可抑制多种血管新生模型的新生血管形成（angiogenesis），甚至可抑制肿瘤的生长和转移，在实体瘤、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的治疗中有广泛的应用前景。现将其近几年的研究情况综述如下。 展开更多

关键词 kringle5 血管新生抑制剂 结构 糖尿病视网膜病变 纤维蛋白溶酶原 改造 内皮细胞增殖 内皮细胞迁移

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腺伴随病毒载体介导Kringle5-GFP基因在眼组织中的表达

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作者 宋哲 黎晓新 《国际眼科杂志》 CAS 2012年第7期1251-1253,共3页

目的:探寻腺伴随病毒载体介导Kringle5基因注入玻璃体腔后,在眼球组织中的分布规律,为基因治疗视网膜病变提供实验依据。方法:将已经构建包装好的rAAV-Kringle5-GFP,滴度为2.5×1012vg/mL10μL注入SD大鼠玻璃体腔后,分别在1,5,10,20... 目的:探寻腺伴随病毒载体介导Kringle5基因注入玻璃体腔后,在眼球组织中的分布规律,为基因治疗视网膜病变提供实验依据。方法:将已经构建包装好的rAAV-Kringle5-GFP,滴度为2.5×1012vg/mL10μL注入SD大鼠玻璃体腔后,分别在1,5,10,20,40,60,90d处死SD大鼠,在荧光显微镜下观察GFP在玻璃体、视网膜、脉络膜、虹膜等眼组织分布及表达情况。根据表达强度从无表达到强表达分别记为-,+,++,+++,++++。结果:在注射后第1d,玻璃体中有轻度表达,随着时间的推移表达缓慢增强,分布较广泛;在玻璃体注射后第5d视网膜有表达,分布范围从视盘到周边部视网膜组织均出现且随着时间的推移表达增强;在虹膜、脉络膜组织表达也有较强表达;甚至在角膜内皮及晶状体组织也有表达。结论:选用腺伴随病毒载体介导目的基因能够在视网膜组织和色素膜组织有较强表达,腺伴随病毒载体介导目的基因是治疗ROP视网膜新生血管较为理想的载体。 展开更多

关键词 rAAV—kringle5-GFP 眼组织 动物实验

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重组人纤溶酶原Kringle5的标记及其肿瘤显像

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作者 李彪 赵龙 +3 位作者 张一帆 尹桂芝 张志勇 朱承谟 《世界肿瘤杂志》 2005年第4期277-277,共1页

目的 探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5（K5）用于肿瘤显像的可行性。方法 采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5（rhK5），以Iodogen法制备^125I-rhK5和^131I-rhK5，进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究。结果 ^125I-rhK5和^... 目的 探讨放射性碘标记纤溶酶原Kringle5（K5）用于肿瘤显像的可行性。方法 采用基因工程方法制备的重组人纤溶酶原Kringle5（rhK5），以Iodogen法制备^125I-rhK5和^131I-rhK5，进行荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像研究。结果 ^125I-rhK5和^13lI-rhK5的标记率为86％和84％，放化纯度为96％和95％。竞争结合实验表明，rhK5标记后其生物活性没有改变；荷瘤裸鼠体内分布显示，12h肿瘤肌肉组织比可达4．94±0．89；^131I-rhK5肿瘤显像示肿瘤部位放射性浓聚随时间逐渐增加，3h可见肿瘤清晰显影。结论 Iodogen法制备^125I-rhK5和^131I-rhK5纯度高，稳定性好。^131I-rhK5可进行肿瘤的显像，为肿瘤的显像和治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 人纤溶酶原 肿瘤显像 kringle5 重组 IODOGEN法 放射性碘标记 基因工程方法 体内分布 荷瘤裸鼠 放化纯度

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