几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达(英文) 被引量：7

1

作者 叶辉 冯春 +2 位作者 程郢 朱苏文 程备久 《激光生物学报》 CAS CSCD 2008年第3期384-390,共7页

几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表... 几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表达载体pET-chiB的诱导表达,实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD。利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃。这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础。 展开更多

关键词 几丁质酶基因 pET-chiB 构建 表达 iptg诱导

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枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达 被引量：4

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作者 李海军 王林刚 +2 位作者 王治泽 陈芳 高剑峰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期90-94,118,共6页

借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长635bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBIGenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性。将... 借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长635bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBIGenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性。将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达。SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21kD。对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD600值为1.8、乳糖诱导浓度为1.5mM、摇瓶发酵10h后大肠杆菌分泌表达26.0U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本。 展开更多

关键词 乳糖诱导 iptg诱导 枯草杆菌 脂肪酶基因 分泌表达

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羚牛IFN-γ基因克隆、生物信息学分析与原核表达

3

作者 柳丽 姚宇航 +4 位作者 刘晨阳 张文涛 马俊杰 昝林森 成功 《西北农业学报》 北大核心 2025年第2期319-328,共10页

旨在研究羚牛γ干扰素(IFN-γ)基因结构与功能,为进一步增强羚牛的免疫调节能力提供理论依据。通过RT-PCR方法克隆羚牛IFN-γ基因,并运用多种生物信息学分析工具对其结构与功能进行深入研究。将IFN-γ基因序列连入原核表达载体,并转化... 旨在研究羚牛γ干扰素(IFN-γ)基因结构与功能,为进一步增强羚牛的免疫调节能力提供理论依据。通过RT-PCR方法克隆羚牛IFN-γ基因,并运用多种生物信息学分析工具对其结构与功能进行深入研究。将IFN-γ基因序列连入原核表达载体,并转化大肠杆菌诱导表达。结果显示,羚牛IFN-γcDNA序列全长501 bp,编码166个氨基酸。蛋白高级结构预测结果显示,二级结构以α螺旋为主,存在13个磷酸化修饰位点,并含有1个信号肽、1个低度复杂区、1个跨膜结构域及1个IFN-γ结构域,其中IFN-γ结构域位于胞外区。序列比对分析发现其与绵羊、山羊、家牛、水牛、人、黑猩猩、小鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99.0%、98.8%、97.2%、96.2%、75.8%、75.4%、64.1%、54.1%,氨基酸序列同源性分别为99.4%、99.4%、95.8%、95.8%、62.7%、62.7%、43.9%、33.5%。系统进化树分析结果显示,羚牛与山羊、绵羊的亲缘关系最近。经SDS-PAGE和Western-blot检测发现,重组IFN-γ蛋白以可溶性形式大量表达,分子质量约为34 ku。通过密码子优化及不同浓度IPTG诱导表达等原核表达优化策略发现,密码子优化能促进重组蛋白的高效表达,且最佳诱导浓度为0.9 mmol·L^(-1)。 展开更多

关键词 羚牛 IFN-Γ 基因克隆 生物信息学分析 原核表达 iptg诱导

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鸡β-防御素Gal-3在大肠杆菌中的诱导表达 被引量：2

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作者 付连军 莫索 +5 位作者 贺元欣 刘欢 王彦 魏刚 张琦 王会岩 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期11-15,共5页

利用IPTG作为诱导剂进行鸡β-防御素-3基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素(IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量)进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件:IPTG的终浓度为0.6mmol/L,诱... 利用IPTG作为诱导剂进行鸡β-防御素-3基因重组蛋白的表达,探讨工程化生产的可能性。分别对影响重组蛋白表达的因素(IPTG浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度和溶氧量)进行优化,最终得到最佳的IPTG诱导条件:IPTG的终浓度为0.6mmol/L,诱导起始吸光度A600为0.6,最适溶氧量为150mL三角瓶装50mL培养基,且在33℃下诱导4h重组蛋白表达量达到最大。该方法为工程化生产提供良好的试验依据。 展开更多

关键词 鸡β-防御素-3 iptg诱导 大肠杆菌 表达

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谷氨酰胺酶基因原核表达载体的构建与表达 被引量：2

5

作者 卢彪 吴拥军 +2 位作者 吴玉俊 罗熹 刘艳敏 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第9期140-142,共3页

为验证谷氨酰胺酶基因glsA2的酶活力,以pET-32a为表达载体构建原核表达重组质粒pET32a-glsA2,转化表达菌株E.coli BL21(DE3)。从异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导浓度及诱导表达时间两方面对重组菌株glsA2基因的表达系统进行... 为验证谷氨酰胺酶基因glsA2的酶活力,以pET-32a为表达载体构建原核表达重组质粒pET32a-glsA2,转化表达菌株E.coli BL21(DE3)。从异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导浓度及诱导表达时间两方面对重组菌株glsA2基因的表达系统进行优化。结果显示,0.1mmol/L IPTG诱导6h,谷氨酰胺酶活力达到608.2U/μg,约为对照的15倍。 展开更多

关键词 谷氨酰胺酶 glsA 原核表达 iptg诱导

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短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达 被引量：4

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作者 黄丹丹 车建美 +1 位作者 刘波 陈庆河 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2014年第9期1757-1763,共7页

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列... 以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。 展开更多

关键词 短短芽胞杆菌 几丁质酶基因 克隆 表达 iptg诱导

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大肠杆菌异质型ACCase亚基基因accB重组表达载体的构建和原核表达 被引量：1

7

作者 王伏林 郎春秀 +1 位作者 吴关庭 陈锦清 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第23期74-77,共4页

生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上,对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。以大肠杆菌E.coli DH5α的DNA为模板,根据大肠杆菌基因组的Ge... 生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上,对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。以大肠杆菌E.coli DH5α的DNA为模板,根据大肠杆菌基因组的Genbank中的核苷酸序列,设计2条特异引物进行扩增,克隆了大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase,ACCase)的生物素羧基载体蛋白亚基基因accB,构建accB的原核表达载体pGEX-4T-accB,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株,IPTG诱导进行融合表达,成功诱导表达了GST-accB融合蛋白,大小为43 kDa,该基因的原核表达为蛋白的纯化和进一步研究其功能及应用打下了良好的基础。 展开更多

关键词 ACCASE accB载体构建 原核表达 iptg诱导

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马铃薯X病毒外壳蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：1

8

作者 万晴姣 李欲轲 +2 位作者 姚东校 乙引 洪鲲 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第23期27-30,共4页

采用RT-PCR技术从感染马铃薯X病毒贵州分离物PVX-GZ的普通烟叶片中扩增出该病毒的外壳蛋白基因CP。测序结果表明,该CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基。构建原核表达载体p ET32a(+)-CP,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在25℃条件... 采用RT-PCR技术从感染马铃薯X病毒贵州分离物PVX-GZ的普通烟叶片中扩增出该病毒的外壳蛋白基因CP。测序结果表明,该CP基因全长714 bp,编码237个氨基酸残基。构建原核表达载体p ET32a(+)-CP,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在25℃条件下以0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthivgalactopyranoside,简称IPTG)诱导表达重组蛋白基因;SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为45 ku;以该重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备的抗体效价达1∶12 800;间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunsorbent assay,简称ELISA)检测显示,该多抗能与PVX病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他5种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。结果为病毒血清学检测试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多

关键词 马铃薯X病毒 外壳蛋白 原核表达 多克隆抗体 CP基因 RT-PCR技术 iptg诱导表达 ELISA检测

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胃癌组织来源的突变型DNA聚合酶β的碱基切除修复功能

9

作者 张成娟 赵四敏 +1 位作者 赵国强 董子明 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期672-676,共5页

目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PC... 目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。 展开更多

关键词 胃癌 DNA聚合酶Β iptg诱导 镍柱亲和层析 碱基切除修复

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Survivin基因融合蛋白的表达与纯化

10

作者 李丽 刘晶 蒋继志 《医学研究与教育》 CAS 2014年第1期13-16,共4页

目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)中最强的凋亡抑制因子,纯化得到其功能结构域(BIR)的融合蛋白可为进一步研究Survivin基因与相关基因的相互作用提供依据。方法利用PCR技术扩增Survivin基因中的BIR序列后连接到pGEX4T-2载体上,经大肠杆... 目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)中最强的凋亡抑制因子,纯化得到其功能结构域(BIR)的融合蛋白可为进一步研究Survivin基因与相关基因的相互作用提供依据。方法利用PCR技术扩增Survivin基因中的BIR序列后连接到pGEX4T-2载体上,经大肠杆菌(DH5α)验证后,转化BL21大肠杆菌菌株并用IPTG进行诱导,以谷胱甘肽琼脂糖亲和层析技术纯化融合蛋白。结果实验扩增得到的BIR片段约为276 bp,纯化得到的融合蛋白分子质量大小约为37 ku。结论PCR结果与预期的片段大小一致,构建重组体后经IPTG在22℃下诱导2 h,菌体中融合蛋白的表达量显著增加,为下一步研究Survivin基因的功能和与其相互作用的蛋白奠定了基础。 展开更多

关键词 pGEX4T-2 iptg诱导 纯化

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鸡Stra8原核表达载体的构建及多克隆抗体血清的制备 被引量：1

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作者 赵宗仪 王颖洁 +2 位作者 靳锴 左其生 张亚妮 《中国家禽》 北大核心 2021年第10期10-16,共7页

试验旨在探究视黄酸介导的Stra8信号在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制。以如皋黄鸡睾丸cDNA为模板扩增Stra8基因CDS区,并与pET-28a载体相连获得原核重组表达载体pET-28a-Stra8,然后转染大肠杆菌BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳... 试验旨在探究视黄酸介导的Stra8信号在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制。以如皋黄鸡睾丸cDNA为模板扩增Stra8基因CDS区,并与pET-28a载体相连获得原核重组表达载体pET-28a-Stra8,然后转染大肠杆菌BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导外源基因表达,离心收集菌液,并用超声波破碎等方法收集表达的蛋白,用纯化的蛋白作为抗原制备兔源抗体,产生带有免疫抗体的兔血;取全血,经血凝离心等步骤后获取血清,通过SDS-PAGE检测抗体的纯度,将获得的含有多克隆抗体的血清进行ELISA检测效价。结果显示:成功构建pET-28a-Stra8重组载体,IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE分析后显示,STRA8蛋白大小约为55 ku;ELISA检测显示在血清稀释比为1∶256000时P/N=3.3>2.1,达到阳性血清合格标准;Western blotting结果显示制备的多克隆抗体血清可结合STRA8蛋白,该结果为进一步研究Stra8在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制提供了基础。 展开更多

关键词 Stra8 原核表达载体 iptg诱导 多克隆抗体

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自诱导在精氨酸脱羧酶表达及催化中的应用

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作者 孙霞 刘建 刘艳玲 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期539-545,共7页

[目的]旨在探求自诱导系统在精氨酸脱羧酶表达活性及催化活性方面的可行性。[方法]采用PCR方法,从Escherichia coli BL21基因组中扩增出精氨酸脱羧酶基因spe A,构建重组菌E.coli BL21-p ET20b(+)-spe A。分别用ZYM-5052自诱导培养基和LB... [目的]旨在探求自诱导系统在精氨酸脱羧酶表达活性及催化活性方面的可行性。[方法]采用PCR方法,从Escherichia coli BL21基因组中扩增出精氨酸脱羧酶基因spe A,构建重组菌E.coli BL21-p ET20b(+)-spe A。分别用ZYM-5052自诱导培养基和LB-IPTG诱导培养基对重组菌株进行诱导,用HPLC法测定酶活性和转化产物含量。[结果]精氨酸脱羧酶基因在大肠杆菌中得到有效表达,其相对分子量为70 k Da。采用自诱导途径表达精氨酸脱羧酶,与IPTG诱导相比,自诱导菌体OD600是其1.95倍,酶活性是其6倍。自诱导比IPTG诱导菌体转化生成胍基丁胺的含量高1.8 g/L,转化率提高12.5%。[结论]精氨酸脱羧酶基因spe A可通过自诱导获得大量表达,且表达活性及催化活性比传统IPTG诱导效果更好,该研究为重组酶的高水平表达提供了有效的方法。 展开更多

关键词 精氨酸脱羧酶 基因克隆和表达 自诱导 iptg诱导 胍基丁胺 生物催化

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假单胞菌M18中藤黄绿菌素合成限速酶基因的鉴定及表达优化 被引量：1

13

作者 李赛男 李慷 +3 位作者 王姝芸 王国昊 黄显清 许煜泉 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期300-308,共9页

【目的】假单胞菌株M18中负责抗真菌剂藤黄绿菌素(Plt)合成的结构基因包括pltLABCDEFG、pltM。为了鉴定Plt合成限速酶的基因,分别将9个结构基因过表达。【方法】以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增这9个Plt合成基因的编码区,分别克隆到... 【目的】假单胞菌株M18中负责抗真菌剂藤黄绿菌素(Plt)合成的结构基因包括pltLABCDEFG、pltM。为了鉴定Plt合成限速酶的基因,分别将9个结构基因过表达。【方法】以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增这9个Plt合成基因的编码区,分别克隆到穿梭载体pME6032的tac启动子下游,构建9个结构基因的过表达载体,并转入假单胞菌株M18中。在KMB培养基中进行Plt发酵分析。【结果】分别携带pltC、pltD、pltF过表达载体的菌株与携带空质粒的菌株相比,Plt产量分别提高了96%、78%、75%。对重组菌株进行IPTG诱导浓度和诱导时间的优化,确定IPTG最佳诱导浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导时间为培养6 h。【结论】pltC、pltD、pltF分别编码的Ⅰ型聚酮合成酶、卤化酶、乙酰CoA合成酶可能为Plt生物合成的限速酶。按照优化条件发酵,携带pltD、pltF过表达质粒的菌株产量分别上升77.5%、159.1%。 展开更多

关键词 假单胞菌株 藤黄绿菌素 限速酶 iptg诱导条件优化

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麻疯树核糖体失活蛋白curcin基因的原核表达及其抗真菌活性的研究 被引量：1

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作者 邵彩霞 秦小波 +10 位作者 蔡峰 辜小平 闫毅武 王成世 徐莺 陈放 Cai-Xia Xiao-Bo Xiao-Ping Yi-Wu Cheng-Shi 《四川大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1793-1797,共5页

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达... 通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达.然后通过纯化原核表达产物,得到纯化的curcin重组蛋白,并以纸片法进行体外抗菌活性检测,发现其具有较强抗真菌活性. 展开更多

关键词 麻疯树核糖体失活蛋白 CURCIN 基因片段 原核表达载体 抗真菌活性 antibacterial activity expression vector 重组蛋白 转化大肠杆菌 JATROPHA curcas gene FRAGMENTS 开放阅读框 重组质粒 体外抗菌 活性检测 纯化 表达产物 iptg诱导 in VITRO reading

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