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Hi-Tag:a simple and efficient method for identifying protein-mediated long-range chromatin interactions with low cell numbers
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作者 Xiaolong Qi Lu Zhang +11 位作者 Qiulin Zhao Peng Zhou Sai Xian Zhang Jingjin Li Zhuqing Zheng Yue Xiang Xueting Dai Zhe Jin Yaobang Jian Xinyun Li Liangliang Fu Shuhong Zhao 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2024年第5期1027-1034,共8页
Protein-mediated chromatin interactions can be revealed by coupling proximity-based ligation with chromatin immunoprecipitation.However,these techniques require complex experimental procedures and millions of cells pe... Protein-mediated chromatin interactions can be revealed by coupling proximity-based ligation with chromatin immunoprecipitation.However,these techniques require complex experimental procedures and millions of cells per experiment,which limits their widespread application in life science research.Here,we develop a novel method,Hi-Tag,that identifies high-resolution,long-range chromatin interactions through transposase tagmentation and chromatin proximity ligation(with a phosphorothioate-modified linker).Hi-Tag can be implemented using as few as 100,000 cells,involving simple experimental procedures that can be completed within 1.5 days.Meanwhile,Hi-Tag is capable of using its own data to identify the binding sites of specific proteins,based on which,it can acquire accurate interaction information.Our results suggest that Hi-Tag has great potential for advancing chromatin interaction studies,particularly in the context of limited cell availability. 展开更多
关键词 hi-tag chromatin interactions transposase tagmentation chromatin proximity ligation low cell numbers
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改性Fe_(3)O_(4)一步纯化固定糖基转移酶合成人参皂苷Rh2
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作者 刘啸尘 岳骏松 +4 位作者 武占省 李志燕 涂旻 石怀琪 范代娣 《西安工程大学学报》 2025年第1期1-8,共8页
游离酶的纯化成本高及其难以重复利用的弊端制约了其在绿色生化工业的应用,而具有良好性能的固定化酶是其工业化的必要条件。为降低糖基转移酶在催化合成人参皂苷Rh2过程中分离纯化的成本及克服游离酶不能重复利用的难题,合成了一种具... 游离酶的纯化成本高及其难以重复利用的弊端制约了其在绿色生化工业的应用,而具有良好性能的固定化酶是其工业化的必要条件。为降低糖基转移酶在催化合成人参皂苷Rh2过程中分离纯化的成本及克服游离酶不能重复利用的难题,合成了一种具磁性的Fe_(3)O_(4)/MPN-Ni^(2+)材料,其可在固定重组糖基转移酶(UGT)的同时完成纯化,所得固定化酶可从反应中快速分离以重复使用。经验证,固定化材料对UGT有特异性吸附作用,且固定化酶(Fe_(3)O_(4)/MPN-Ni^(2+)@UGT)具有高的载酶量(100.91 mg/g)和稳定性,6个循环后仍保持了65.07%的活性。储存21 d后,活性仍有54.01%。最适条件下,固定化酶可催化合成40.73μg/mL的Rh2,且底物人参二醇(PPD)的转化率为70.88%。这种低成本、高效、稳定的材料在酶纯化和合成人参皂苷方面具有巨大的工业应用潜力和价值。 展开更多
关键词 酶固定化 糖基转移酶 磁性纳米粒子 His标签 人参皂苷RH2
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His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性 被引量:9
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作者 曾瑞红 王卫华 +3 位作者 房桂珍 龚伟 梅兴国 魏林 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1066-1070,共5页
目的:观察His-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-His和pET-DsbA-His中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得His-G1F/M2和DsbA-His-G1F/M2,将后者用... 目的:观察His-tag是否影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。方法:PCR扩增G1和F/M2基因片段,插入表达载体pET-His和pET-DsbA-His中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和层析法纯化得His-G1F/M2和DsbA-His-G1F/M2,将后者用凝血酶消化,再经Ni+螯合亲和层析法纯化得G1F/M2,将His-G1F/M2和G1F/M2免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果:两种蛋白在BALB/c小鼠中诱导的RSV特异性抗体和CTL活性无显著差异。结论:His-tag不影响RSV重组蛋白G1F/M2的免疫原性。 展开更多
关键词 呼吸道合胞病毒 HIS-TAG 重组蛋白G1F/M2 免疫原性
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His标签单克隆抗体的制备及交叉抗原的表位分析 被引量:8
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作者 赵向绒 张海祥 +5 位作者 刘杨 王鑫 王光华 齐宗利 李元 胡军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期683-687,692,共6页
目的研究His标签对重组蛋白在疫苗、免疫和致病等方面的影响。方法制备His标签的单克隆抗体(m Ab),通过ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色方法研究其生物学特性、免疫反应特性以及与人体组织的反应性。结果 His标签m Ab和抗原的... 目的研究His标签对重组蛋白在疫苗、免疫和致病等方面的影响。方法制备His标签的单克隆抗体(m Ab),通过ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色方法研究其生物学特性、免疫反应特性以及与人体组织的反应性。结果 His标签m Ab和抗原的结合与空间构型有关,多数抗His标签m Ab可以与血红蛋白结合,亦可与人体多种正常组织反应。结论带His标签的重组蛋白进行体内实验时可刺激机体产生抗His标签的抗体,该抗体可与血红蛋白及人体正常组织结合而影响重组蛋白的后期研究。 展开更多
关键词 His标签 重组蛋白 单克隆抗体 空间构型
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6×His-tag在抗菌肽表达纯化中的应用及其对抗菌肽活性的影响 被引量:8
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作者 牛明福 李翔 +2 位作者 邢广旭 张红梅 宫强 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2008年第12期121-124,共4页
为方便抗菌肽的体外表达和纯化,以蝎子防御素为对象,在其编码基因末端加入6×His-tag,在酵母表达系统中表达,获得有活性的防御素Sd和融合蛋白Sd-His。进一步纯化、体外抑菌活性及热酸稳定性等试验发现,6×His-tag不但没有降低... 为方便抗菌肽的体外表达和纯化,以蝎子防御素为对象,在其编码基因末端加入6×His-tag,在酵母表达系统中表达,获得有活性的防御素Sd和融合蛋白Sd-His。进一步纯化、体外抑菌活性及热酸稳定性等试验发现,6×His-tag不但没有降低防御素的抑菌活性,反而有稍微的增强趋势。结果表明,6×His-tag可用于抗菌肽的融合表达且不影响其活性,为抗菌肽的表达纯化提供了一个更简便有效的方法。 展开更多
关键词 6×His—tag 抗菌肽 表达纯化 抑菌活性 热酸稳定性
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镍离子亲和层析介质的制备及其用于组氨酸标记蛋白质的纯化 被引量:9
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作者 夏海锋 张显 +3 位作者 金雄华 刘婷婷 郑志永 饶志明 《江南大学学报(自然科学版)》 CAS 2010年第6期685-689,共5页
以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0μmol/mL,最终N i2+配基密度达到了30.9μmol/mL,偶联效率为81.3%。利用得到的镍... 以交联琼脂糖微球为基质,通过环氧氯丙烷活化,偶联亚胺二乙酸并螯合N i2+,制备得到一种镍离子亲和层析介质。结果发现,在强碱条件下环氧活化率达到了38.0μmol/mL,最终N i2+配基密度达到了30.9μmol/mL,偶联效率为81.3%。利用得到的镍离子亲和介质对基因工程大肠杆菌表达的组氨酸标记3-羟基丁酮还原酶进行了一步层析纯化,酶活回收率达到了58.8%,纯化倍数为2.1,蛋白纯度在85%左右,纯化效果与常用商品介质基本相当。 展开更多
关键词 琼脂糖微球 镍离子亲和层析 组氨酸标记 克隆表达 纯化
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SDS-PAGE 法测定His-tag 融合蛋白分子量产生偏差的原因 被引量:125
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作者 唐威华 张景六 +1 位作者 王宗阳 洪孟民 《植物生理学报(0257-4829)》 CSCD 2000年第1期64-68,共5页
Histag/NiNTA系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。SDSPAGE是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测Histag融合蛋白时... Histag/NiNTA系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白的有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。SDSPAGE是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测Histag融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大,产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题,本实验室在研究一个Histag融合蛋白P73His时,首先用SDSPAGE法测得其分子量确实比理论计算值大,然后对其进行C末端氨基酸顺序测定、电喷雾质谱分析,结果证实其实际分子量与理论值一致。酶切去除包括Histag在内的部分肽段使SDSPAGE法测量蛋白分子量的偏差大大降低,证实Histag确实是造成偏差的原因之一。推测由于Histag中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在SDSPAGE中迁移变慢,而导致偏差。这一现象值得引起有关研究者的注意。 展开更多
关键词 融合蛋白 SDS-PAGE 分子量 HIS-TAG Ni-NTA
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基于Fe_3O_4@SiO_2/Ni-NTA磁性微球的His-tag融合蛋白纯化体系的建立 被引量:6
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作者 王文加 郭晓林 +2 位作者 韦安慧 付常皓 韩振国 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2012年第2期303-307,共5页
合成了表面共价结合Ni-氨基三乙酸(Ni-NTA)基团的Fe3O4@SiO2微球,这种磁性微球可用于分离含有His-tag标签的融合蛋白.微球中心由尺寸约402 nm的Fe3O4微粒组成,赋予了微球极好的磁性分离和离心分离的特性.应用Fe3O4@SiO2/Ni-NTA磁性微球... 合成了表面共价结合Ni-氨基三乙酸(Ni-NTA)基团的Fe3O4@SiO2微球,这种磁性微球可用于分离含有His-tag标签的融合蛋白.微球中心由尺寸约402 nm的Fe3O4微粒组成,赋予了微球极好的磁性分离和离心分离的特性.应用Fe3O4@SiO2/Ni-NTA磁性微球对含有6×His-tag(6聚组氨酸)标签的蛋白进行了分离纯化,结果表明,10 mg Fe3O4@SiO2/Ni-NTA微球能够从10 mL重组蛋白裂解液中纯化出约1 mg带有6×His-tag标签的融合蛋白.微球的高效分离效果使其能够用于含量较低的带有6×His-tag标签蛋白的分离纯化. 展开更多
关键词 磁性微球 6×His-tag蛋白 亲和纯化 Ni-氨基三乙酸
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含组氨酸纯化标签的假病毒表达载体的构建与应用 被引量:7
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作者 肖性龙 余以刚 +2 位作者 翟建新 李惠芳 吴晖 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期687-692,共6页
为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法.通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签... 为了RNA类病毒进行核酸检测提供一种更稳定、更方便的全程监控技术,本文研究了含组氨酸纯化标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法.通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,成功构建带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体.外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度、高纯度的假病毒,在4℃和-20℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上. 展开更多
关键词 假病毒 组氨酸标签 表达载体 检测
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角蛋白酶产生菌的分离鉴定及其kerC的克隆表达 被引量:4
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作者 侯晟琦 王丽华 +3 位作者 赖欣 陈惠 吴琦 韩学易 《中国环境科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1845-1852,共8页
以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的... 以四川农业大学养鸡场堆砌废弃羽毛处土壤为样品,筛选出一株具有较强降解羽毛能力的细菌B-3菌株.经形态学、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌B-3.并成功克隆到该菌株的角蛋白酶基因kerC(GenBank No.:JN021789),在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中获得了高效表达.该基因全长1146bp,GC含量46.5%,编码381个氨基酸,与已报道的枯草芽孢杆菌YYW-1的kerC基因(GenBank No.:EU362730)同源性达到100%.重组菌株经IPTG诱导后角蛋白酶酶活力达14.8U/mL,经His-Tag纯化和SDS-PAGE分析表明,重组角蛋白酶分子量约为60kDa(融合了硫氧还蛋白,Trx).重组角蛋白酶最适反应温度和pH值分别为65℃与7.0. 展开更多
关键词 角蛋白酶 枯草芽孢杆菌B-3 基因克隆 kerC基因 原核表达 HIS-TAG
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一种带有组氨酸标签的新型表达载体的构建及应用 被引量:4
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作者 齐向辉 孙储鹏 +5 位作者 何晨曦 沈琦 刘学 郭齐 陈华友 徐虹 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期52-54,共3页
目的:利用基因重组技术,对已有载体pSE380进行改造,获得具有组氨酸标签的新型表达载体。方法:以pSE380载体为出发材料,通过一步反向PCR技术在多克隆位点处添加一个六聚组氨酸纯化标签,并用该载体对xdh外源基因进行克隆表达及纯化验证。... 目的:利用基因重组技术,对已有载体pSE380进行改造,获得具有组氨酸标签的新型表达载体。方法:以pSE380载体为出发材料,通过一步反向PCR技术在多克隆位点处添加一个六聚组氨酸纯化标签,并用该载体对xdh外源基因进行克隆表达及纯化验证。结果:测序结果显示该标签已成功插入,xdh基因克隆表达及纯化表明,镍柱亲和层析完全可以将重组的表达蛋白纯化,并达到电泳纯级别,融合标签并没有影响的该重组酶的功能。结论:通过一步反向PCR技术成功地获得了改造pSE380载体,该技术为载体的相关改造提供了一种方便可行的方法。 展开更多
关键词 pSE380 表达载体 His标签 一步反向PCR
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嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达 被引量:2
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作者 潘渠 胡福泉 +3 位作者 陈恬 邱岳 王广科 李晋川 《成都医学院学报》 CAS 2009年第2期86-90,共5页
目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b-lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产... 目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b-lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2.28kU/L.而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。 展开更多
关键词 嗜酸乳杆菌 Β-半乳糖苷酶 克隆表达 HIS-TAG 复性
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栓菌漆酶的异源表达及重组酶碳端和氮端组氨酸标签修饰对酶学特性的影响 被引量:2
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作者 刘英丽 刘骏明 +2 位作者 王静 孙宝国 THIERRY Tron 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第21期143-148,共6页
以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性... 以来源Trametes sp.C30的LAC3漆酶基因为研究对象,通过引物设计进行突变,在其C端和N端进行延长,分别引入6个组氨酸标签,并异源表达于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中,将获得的重组酶进行比较发现漆酶末端氨基酸序列的改变对酶学性质的影响较大。C端引入组氨酸标签的重组酶的表达量不受影响,但是在N末端引入组氨酸标签的重组酶表达量只有LAC3的一半。添加组氨酸标签的融合蛋白对ABTS和SGZ两种底物的亲和力得到增强。而在酸碱稳定性耐受方面,与LAC3相比,N末端氨基酸的改变使其在酸碱稳定性方面得到了增强,中碱性条件下仍能保持较佳活性。C端和N端可塑性的研究对于漆酶新性状的获得具有重要意义。 展开更多
关键词 漆酶 异源表达 组氨酸标签 碳端 氮端
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铁镍磁性微球直接纯化组氨酸标签蛋白 被引量:2
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作者 刘宝全 张停停 +5 位作者 鲍丽 吕晓菊 王佳宁 张艳梅 王剑锋 范圣第 《化学研究与应用》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1569-1573,共5页
以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为N... 以氯化铁与硫酸镍为主要原料基于热分解法原理一锅法合成铁镍磁性微球。氯化铁、硫酸镍和乙酸钠在(80℃)乙二醇中搅拌30 min,在氮气保护下,加入乙醇胺后180℃搅拌6h,经过水清洗与乙醇清洗后获得有磁性的含镍微球,XRD检测结果证实晶型为Ni Fe2O4,晶体的平均粒径为6.75 nm。磁性微球不经任何修饰直接与组氨酸标签蛋白结合,完成带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白纯化,SDS-PAGE检测结果表明:使用5倍于镍配位凝胶质量的铁镍磁性微球可达到与镍配位凝胶相近的蛋白质吸附量。低成本的铁镍磁性微球可以替代镍配位凝胶用于组氨酸标签蛋白的分离纯化。 展开更多
关键词 铁镍磁性微球 热分解法 组氨酸标签 蛋白纯化
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人干细胞因子受体膜外区1~3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性 被引量:2
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作者 苏林 刘长征 +3 位作者 邓艳春 杨克恭 梁植权 陈松森 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期154-158,共5页
目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1~3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1~3),研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1~3双突变片段(c-Kit/Ig1~3DM),构建pET16b-c-Ki... 目的 在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1~3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1~3),研究其配体结合活性.方法 采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1~3双突变片段(c-Kit/Ig1~3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1~3DM表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1~3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1~3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果 在大肠杆菌中c-Kit/Ig1~3^DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1~3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1~3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1~3融合蛋白. 展开更多
关键词 人干细胞因子受体 免疫球蛋白样结构域 HIS-TAG pull-down 酶联免疫结合实验
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组氨酸标签木聚糖酶的构建表达和酶特性鉴定 被引量:2
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作者 熊海容 陈丰 +1 位作者 王亚伟 张巍 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2014年第3期27-31,共5页
通过改变终止密码子位点,在一个耐热木聚糖酶突变株DSB的C末端添加了6聚组氨酸标签( His-tag ),并完成了表达和酶特性鉴定.通过PCR将嗜热真菌DSM 10635来源的木聚糖酶突变体基因dsb的终止密码子序列定点突变为谷氨酸密码子序列,... 通过改变终止密码子位点,在一个耐热木聚糖酶突变株DSB的C末端添加了6聚组氨酸标签( His-tag ),并完成了表达和酶特性鉴定.通过PCR将嗜热真菌DSM 10635来源的木聚糖酶突变体基因dsb的终止密码子序列定点突变为谷氨酸密码子序列,连接到表达载体pET-22b(+),转化Escherichia coli.BL21(DE3),诱导表达的耐热木聚糖酶DSB在C端含有6×His-tag.表达产物经硫酸铵分级沉淀和Ni Sepharose层析纯化,获得了电泳纯重组酶DSB.结果表明:添加组氨酸标签的酶与原始酶相比,酶学特性无变化.SDS-PAGE电泳结果显示该酶分子量约为23 kDa,重组酶最适pH为6.5,最适温度为75℃,在pH 5~10具有良好的稳定性,在pH 6.5,70℃条件下处理30 min相对酶活力仍保留80%以上. 展开更多
关键词 耐热木聚糖酶 多聚组氨酸标签 定点突变 镍亲和层析 酶学特性
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重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的表达及生物学活性分析 被引量:1
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作者 应跃斌 李丹曦 +3 位作者 潘映秋 薛乔 孙红颖 陈枢青 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期144-147,151,共5页
目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析。方法通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至... 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析。方法通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达。利用亲和层析纯化rSEC2,并采用MTT法对纯化后的rSEC2和天然SEC2生物学活性进行研究和比较。结果表达质粒pET-28a-SEC2通过测序,表明已连入正确表达目的蛋白的核苷酸序列。含有该质粒的表达菌株经IPTG诱导,产生约占菌体总蛋白40%的可溶性重组蛋白。SDS-PAGE显示,经Ni2+亲和柱纯化的目的蛋白达到了电泳纯。MTT法表明该rSEC2和天然SEC2均有显著的超抗原活性。结论成功构建了pET-28a-SEC2表达质粒,获得了与天然SEC2有着类似超抗原活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础。 展开更多
关键词 肠毒素 超抗原 克隆表达 组氨酸标签 亲和纯化
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含非洲马瘟病毒部分核酸序列的病毒样颗粒的研制 被引量:1
18
作者 孙敏 梁成珠 +4 位作者 王群 张晓文 肖西志 耿娟 陈吉祥 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期637-643,共7页
VP7蛋白是非洲马瘟病毒(AHSV)群特异性蛋白,其编码基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测的靶标基因。本研究旨在构建耐RNase的内含AHSV部分核酸序列的病毒样颗粒。首先合成S7基因保守序列,然后克隆到含有噬菌体包膜蛋白... VP7蛋白是非洲马瘟病毒(AHSV)群特异性蛋白,其编码基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测的靶标基因。本研究旨在构建耐RNase的内含AHSV部分核酸序列的病毒样颗粒。首先合成S7基因保守序列,然后克隆到含有噬菌体包膜蛋白基因的带组氨酸纯化标签的假病毒表达载体pNH-MS2his上,成功构建原核表达载体pNH-MS2his-VP7。将重组质粒pNH-MS2his-VP7转化BL21(DE3),并进行诱导表达及镍离子亲和层析纯化后,得到含AHSV部分RNA片段的病毒样颗粒。试验证实该病毒样颗粒均匀性和稳定性良好,可作为AHSV PCR检测的质控品和标准品使用。 展开更多
关键词 非洲马瘟病毒 组氨酸标签 病毒样颗粒 检测
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His-tag对亚油酸异构酶在大肠杆菌中可溶性表达的影响 被引量:1
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作者 张白曦 许正凯 +4 位作者 汪昶沛 陈海琴 宋元达 陈卫 张灏 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2012年第18期217-220,共4页
为了研究6×His-tag对来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)可溶性重组表达的影响,我们构建了三种大肠杆菌重组菌株,表达了三种重组PAI:C端带有His-tag亲和标签、N端带有His-tag亲和标签和不加His-tag亲和标签。通过SDS-PAGE和Wes... 为了研究6×His-tag对来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)可溶性重组表达的影响,我们构建了三种大肠杆菌重组菌株,表达了三种重组PAI:C端带有His-tag亲和标签、N端带有His-tag亲和标签和不加His-tag亲和标签。通过SDS-PAGE和Westernblot分析重组蛋白表达情况,并利用气相色谱检测酶活。实验结果表明:在相似的诱导表达条件及生长状态下,三种大肠杆菌重组菌株均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组蛋白质,三种重组PAI的表达总量相当,6×His-tag的融合表达促进了PAI蛋白质包涵体的形成,而C端6×His-tag带来的影响最大。 展开更多
关键词 亚油酸异构酶 大肠杆菌 6×His-tag 可溶性
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GST-β-catenin-His双标签融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定 被引量:4
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作者 尹会龙 袁莉 《中国科学院研究生院学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期847-852,共6页
应用RT-PCR技术扩增β-catenin的cDNA序列,并且在基因下游引入6×His标签序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1.经测序鉴定后,将重组质粒转入BL21pLysS感受态细菌,经IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose 4B和Ni柱分步纯化GST-β-cateni... 应用RT-PCR技术扩增β-catenin的cDNA序列,并且在基因下游引入6×His标签序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1.经测序鉴定后,将重组质粒转入BL21pLysS感受态细菌,经IPTG诱导表达,采用Glutathione Sepharose 4B和Ni柱分步纯化GST-β-catenin-His融合蛋白.所得产物经SDS-PAGE检测,在114 kDa处显示特异条带,与GST-β-catenin-His融合蛋白预期分子量相符.经Western Blotting鉴定,所纯化蛋白能被β-catenin抗体、GST抗体和His抗体识别,为进一步研究β-catenin的功能提供了基础和前提. 展开更多
关键词 Β-连环蛋白 纯化 GST-His双标签 Western BLOTTING
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