嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究 被引量：1

1

作者 杨鎏 毛曦 +1 位作者 刘英 李建勇 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1075-1079,F0002,共6页

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间。方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs。用带有e... 目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间。方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs。用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况。结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性。MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达。MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力。结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月。本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据。 展开更多

关键词 间充质干细胞 Ad5/f35腺病毒载体 转染 绿色荧光蛋白 大鼠

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5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较 被引量：5

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作者 陈鹏 谭晓华 +1 位作者 马晶莹 邱实 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第19期3713-3718,共6页

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在... 背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成。材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病。方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性。用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察。主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例。结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%。人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14d油红O染色均为阳性。Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%;后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%。在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上。在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下。结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 腺病毒载体 5型和5/f35杂合型 转染效率

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携带全长抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20载体构建与表达研究

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作者 杨秋梅 吴红平 +4 位作者 周秀梅 李林芳 王春红 姜梨华 钱其军 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2009年第5期743-746,共4页

构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力。合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合... 构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力。合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒骨架质粒pAd5F11b进行重组,获得Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒。将鉴定正确的病毒空斑感染293细胞,ELISA检测其表达水平以及间接免疫荧光检测该病毒表达抗体的特异性。结果表明,嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20在293细胞中的表达量高达3.78μg/ml±0.30μg/ml,间接免疫荧光(IFA)显示该病毒表达的抗体只与CD20+的Raji细胞有特异性结合,而与CD20-的Molt-4细胞无结合能力。成功构建了高效表达抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20。 展开更多

关键词 全长抗体 嵌合型腺病毒Ad5f11b 抗CD20抗体 IRES

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AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究 被引量：6

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作者 王凯 彭建强 +1 位作者 袁振华 吴小兵 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第3期525-528,共4页

本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜... 本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。 展开更多

关键词 AD5/f35型腺病毒载体 AD5型腺病毒载体 感染效率 细胞毒作用 造血系统肿瘤细胞

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高感染力嵌合型腺病毒载体的构建及其感染力的流式细胞术测定

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作者 马炬明 苏长青 +3 位作者 王伟国 施建国 胡慧珍 李林芳 《实用癌症杂志》 2007年第6期565-568,共4页

目的构建1种35型腺病毒(Ad35)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒载体,探索该腺病毒载体感染肿瘤细胞的效率。方法PCR扩增Ad35腺病毒Fiber序列,插入并置换Ad5的Fiber序列,构建Ad5-F35嵌合型腺病毒载体,使之携带绿色荧光蛋白报... 目的构建1种35型腺病毒(Ad35)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒载体,探索该腺病毒载体感染肿瘤细胞的效率。方法PCR扩增Ad35腺病毒Fiber序列,插入并置换Ad5的Fiber序列,构建Ad5-F35嵌合型腺病毒载体,使之携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP;以MOI=5的Ad5-F35EGFP病毒感染度感染淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901,流式细胞术检测EGFP表达,借以判断病毒感染细胞的能力。结果成功构建携带EGFP的嵌合型腺病毒载体pAd5-F35EGFP,并在293细胞中重组出Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒,扩增纯化后病毒滴度达到3.4×109pfu/ml;流式细胞仪检测发现,Ad5-F35EGFP在淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901内表达EGFP的强度明显比传统的Ad5-EGFP提高。结论Ad5-F35嵌合型腺病毒感染肿瘤细胞的能力明显增强,为提高腺病毒载体转染抗肿瘤基因的效率、改进肿瘤基因治疗的临床疗效奠定了基础。 展开更多

关键词 肿瘤 基因治疗 腺病毒载体 35型腺病毒 5型腺病

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受人E2F1启动子调控的条件复制型腺病毒载体的构建与鉴定

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作者 韦芳 王慧萍 +1 位作者 张巨峰 李惠明 《山西医科大学学报》 CAS 2011年第12期945-949,共5页

目的构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体。方法以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT ... 目的构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体。方法以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT p-E1A酶切得到的E1A基因,插入线性化的pE2F1 p-EGFP,构建pE2F1 p-E1A;酶切重组质粒pE2F1 p-E1A产生受E2F1基因启动子调控E1A的完整表达框,插入质粒pDC311中,构建腺病毒包装穿梭质粒pDC311-E2F1 p-E1A,与腺病毒骨架质粒pBHGlox△1,3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制型腺病毒Ad-E2F1 p-E1A;扩增病毒并分别感染E2F1活性增强的系列肿瘤细胞株,利用病毒空斑形成实验检测重组条件复制型病毒的条件复制能力。结果限制性内切酶鉴定显示重组质粒构建成功,受人E2F1基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体仅在E2F1活性增强的肿瘤细胞株中实现条件性复制。结论构建的新型条件复制型腺病毒载体具有良好的选择性复制能力,在E2F1活性增强的肿瘤治疗方面有良好的应用前景。 展开更多

关键词 条件复制型腺病毒 载体构建 E2f1启动子

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人35型及11型腺病毒的研究进展 被引量：3

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作者 陈东锋 石文芳 钱其军 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第6期471-474,共4页

人35型(Ad35)和11型(Ad11)腺病毒同属于B2亚群,病毒受体均为CD46分子,Ad35和Ad11的中和抗体在不同地区不同人种的阳性率都比较低,且对肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等一些传统的5型和2型腺病毒嗜性较低的细胞有较高的感染效率,而且... 人35型(Ad35)和11型(Ad11)腺病毒同属于B2亚群,病毒受体均为CD46分子,Ad35和Ad11的中和抗体在不同地区不同人种的阳性率都比较低,且对肿瘤细胞、造血干细胞、树突状细胞等一些传统的5型和2型腺病毒嗜性较低的细胞有较高的感染效率,而且转移基因的表达水平较高,提示Ad11和Ad35是一类具有良好开发潜力的肿瘤基因治疗载体。目前,开发利用Ad35或Ad11主要有三种形式嵌合型腺病毒载体、复制缺陷的35型或11型腺病毒载体和嵌合型的35型或11型“gutless”腺病毒载体。这些载体的体外疗效较好,但体内疗效不理想,原因主要是病毒颗粒在从注射部位到达靶组织会被多重屏障所拦截。因此,深入研究Ad35和Ad11感染细胞的过程和机制,有助于将它们应用于包括肿瘤在内多种重大疾病的基因治疗。 展开更多

关键词 人11型腺病毒 人35型腺病毒 肿瘤基因治疗 载体

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表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

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作者 马亚林 柴鹏弟 +4 位作者 王金冬 毛彤瑶 张鹏 李慧莹 段招军 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期515-522,共8页

目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表... 目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象。结果通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到2.016×10^(10),2.52×10^(10)和2.948×10^(11)IU/mL。pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M。结论成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 人5型腺病毒载体 人呼吸道合胞病毒 融合前f蛋白 HEK293细胞

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共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响 被引量：1

9

作者 张璇 张玉萍 谭晓华 《实用癌症杂志》 2013年第3期221-226,共6页

目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L... 目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。 展开更多

关键词 CD40配基 白细胞介素-2 白细胞介素-12 5 f35嵌合型腺病毒载体 树突状细胞

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重组嵌合腺病毒35型和重组痘苗病毒SIV疫苗在小鼠体内联合免疫的实验研究 被引量：2

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作者 何小周 杨靖 +2 位作者 李红霞 郝彦哲 冯霞 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期455-459,共5页

目的研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡... 目的研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡拉株(rMVA-SIVenvT)进行体外鉴定。采用两种不同的策略联合免疫BALB/c小鼠,即同源载体免疫和异源载体免疫。通过ELISPOT方法检测小鼠脾脏中分泌SIV Env特异性IFN-γ的淋巴细胞数量,ELISA方法检测血清SIV gp120抗体滴度,比较两种免疫策略诱导小鼠产生细胞和体液免疫应答的差异。结果rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT均能在HEK293细胞中有效表达SIVenvT蛋白。初次免疫后第4周,两组SIV Env特异性细胞免疫应答和SIV gp120抗体均达到峰值,随后呈波动下降趋势。异源免疫组诱导小鼠的应答水平高于同源组,其中第4周和第16周异源组细胞免疫应答强度显著高于同源组,第4周异源组SIV gp120抗体滴度显著高于同源组。结论rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT两种载体疫苗联合免疫策略能诱导小鼠产生较强细胞和体液免疫应答。 展开更多

关键词 重组嵌合腺病毒35型 重组痘苗病毒安卡拉株 细胞免疫 体液免疫 猴免疫缺陷病毒

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Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine^(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较 被引量：2

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作者 成凤 王秦 +4 位作者 匡文斌 李朴 董晋豫 梁勤东 涂植光 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第11期1444-1448,共5页

目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP... 目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 腺病毒 Ad5f35型 Ad5型 脂质体 转染效率

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