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抗营养因子大豆凝集素夹心ELISA检测方法的建立
1
作者 胡骁飞 杨继飞 +3 位作者 邢云瑞 庞杏豪 孙亚宁 魏凤仙 《西北农业学报》 北大核心 2025年第1期133-139,共7页
为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工... 为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工作浓度及反应时间优化,建立SBA的双抗体夹心ELISA检测方法,并用建立的方法检测大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。结果表明:建立SBA双抗夹心ELISA检测方法的检测范围为39.06~1250 ng/mL,检出限为3.00 ng/mL,样品添加回收率为77.96%~116.15%,变异系数为6.11%~18.34%,与大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI,大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗营养因子均无交叉反应。大豆中SBA含量显著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);大豆粕中SBA含量显著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);膨化大豆粕显著高于酶解大豆粕中SBA含量(P<0.05)。综上,本研究建立了灵敏度高、特异性好的SBA双抗夹心ELISA检测方法,该方法可用于饲料中大豆凝集素的监控检测。 展开更多
关键词 大豆凝集素 抗营养因子 多克隆抗体 单克隆抗体 夹心elisa
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
2
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接elisa方法 抗体检测 净化
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一种快速精准检测各种乳品中牛乳铁蛋白含量的广适性ELISA方法
3
作者 张婧 朱孔迪 +3 位作者 刘传铭 刘长振 王鹏杰 黄家强 《中国乳业》 2025年第3期91-99,共9页
[目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区... [目的]验证夹心法ELISA技术是否可成为包括风味发酵乳在内的各种乳制品中牛乳铁蛋白含量的精准检测方法。[方法]利用优化的夹心法ELISA检测试剂分别检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液、巴氏杀菌乳样本、加标巴氏杀菌乳样本、12种北京地区市场常见的风味发酵乳、7种加标风味发酵乳、7种混合巴氏杀菌乳的风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量,计算加标回收率及CV值。用该检测试剂检测3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白对72℃热处理的敏感度;并与牛乳铁蛋白国标检测(高效液相色谱法)方法对比检测生乳和巴氏灭菌乳。[结果]该检测试剂可检测牛乳铁蛋白(LTF)标准品溶液和巴氏杀菌乳样本中牛乳铁蛋白,且加标回收率91.7%~106.4%。经检测,12种风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量为无;7种加标风味发酵乳的加标回收率86.3%~109.1%,且检测CV值远低于12%;7种风味发酵乳与巴氏杀菌乳混合乳中牛乳铁蛋白含量与对照组比值在92.3%~110.5%,且大多数检测CV值远低于12%;3种加标风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量随72℃加热时间延长而降低,且下降曲线相似。与国家标准方法对比分析,夹心法ELISA方法检测生乳和巴氏杀菌乳乳铁蛋白含量的符合率分别为97.54%、111.2%,说明该检测方法的准确性达到国标标准。[结论]夹心法ELISA检测试剂可精准检测风味发酵乳中牛乳铁蛋白含量。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 风味发酵乳 夹心法elisa
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基于猪附红细胞体膜蛋白的间接ELISA检测方法的建立及初步应用
4
作者 徐颖 王金琦 +5 位作者 王淼 金鑫 朴政霖 韩天龙 薛书江 吕舟 《延边大学农学学报》 2025年第1期59-64,共6页
为建立有效的猪附红细胞体病间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,该试验利用猪附红细胞体水溶性膜蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体病间接ELISA检测方法。结果表明:提取的猪附红细胞体... 为建立有效的猪附红细胞体病间接酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,该试验利用猪附红细胞体水溶性膜蛋白为包被抗原,优化反应条件,建立了猪附红细胞体病间接ELISA检测方法。结果表明:提取的猪附红细胞体脂溶性膜蛋白的分子量主要集中在25~35Ku;猪附红细胞体水溶性膜蛋白的分子量主要集中在45~180Ku。建立的间接ELISA检测方法最佳反应条件:膜蛋白最佳包被浓度为0.15μg/μL;最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2h;血清最佳稀释倍数为1∶320;酶标二抗最佳稀释倍数为1∶2000;TMB显色时间为37℃5min。特异性试验中,包被抗原与弓形虫、猪肺炎支原体,以及猪大肠杆菌阳性血清无交叉反应。重复性试验结果显示,批内变异系数为2.62%~8.89%,批间变异系数为5.49%~9.65%。对40份猪血清进行检测,建立的间接ELISA方法检出阳性样品19份,阳性率为47.5%。这说明建立的间接ELISA检测方法特异性强、敏感性高,将为猪附红细胞体病的临床诊断提供准确便捷的血清学检测手段。 展开更多
关键词 猪附红细胞体 膜蛋白 临床检测 间接elisa检测方法 抗体检测
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立
5
作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接elisa
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非洲猪瘟病毒pK205R蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立
6
作者 王燕 邹艳丽 +11 位作者 何佳依 刘珊 苗雨润 任炜杰 王振忠 白昀 陈欢 钱莺娟 贾红 吴晓东 冯志新 郑龙三 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第2期105-111,共7页
旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、... 旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、重复性,并对临床血清样品进行检测。结果显示:pK205R蛋白可以与ASFV阳性血清发生发应,ELISA方法的抗原包被浓度为50 ng/孔,4℃过夜包被,封闭液为2%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭1 h,待检血清以5%脱脂乳进行1∶200稀释,37℃孵育0.5 h;二抗工作浓度为1∶5000,37℃孵育0.5 h,37℃下显色10 min;该方法的阳性临界值为0.186(≥0.186为阳性,<0.186为阴性),且具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒符合率为79.92%。本研究成功建立pK205R非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制非洲猪瘟抗体的快速检测试剂盒提供了参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pK205R蛋白 间接elisa 杆状病毒表达
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体制备与竞争ELISA方法的建立
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作者 何启杰 农作荣 +7 位作者 王豪 牛晨霞 莫勇芳 欧阳康 陈樱 黄伟坚 黄稳妃 韦祖樟 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期23-29,共7页
依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其... 依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其特异性。随后建立竞争ELISA方法,并对实验室收集的2016-2019年广西11个地区64个规模猪场592份猪血清进行SVA抗体检测。结果显示,诱导表达出的重组VP2蛋白主要以可溶性形式表达,血清中VP2抗体效价大于1∶64000,且制备的VP2抗体能特异结合SVA感染细胞中的VP2蛋白。竞争ELISA检测结果显示广西地区猪场SVA血清阳性率高达76.6%,血清样品阳性率高达55.9%,研究结果为SVA的检测和研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡 VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 竞争elisa
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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
8
作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) VP6蛋白 截短表达 间接elisa
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动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断方法的建立
9
作者 庄勇 向蒙 +6 位作者 冯桂丹 杨显超 夏炉明 肖文轩 张蒙 王建 张鹭 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期125-133,共9页
本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动... 本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断的方法。该方法适用于实验室样品批量检测,其敏感性为0.912,特异性为0.949。应用本研究建立的动物结核分枝杆菌间接ELISA法和商品化动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒共检测犬、猫、野生动物、SPF实验动物血清共552份。其中间接ELISA方法共检出6份血清抗体阳性,阳性检出率为1.09%(6/552);商品化夹心法试剂盒共检出8份血清抗体阳性,阳性检出率为1.45%(8/552);两者之间阳性重合数为6份,阳性重合率为85.72%(6/7);阴性重合数为544份,阴性重合率为99.82%(544/545)。结果表明,两种诊断方法的检测结果具有较高的一致性。本方法的建立,与国外商品化试剂盒比较,不但有望实现这类检测产品的国产替代,同时实现了一种方法对不同物种来源血清的快速检测。 展开更多
关键词 抗原 结核分枝杆菌复合群 ECX 间接elisa
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胞内劳森菌夹心ELISA检测方法的建立与应用
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作者 洪润婧 周红 +1 位作者 蔺辉星 范红结 《中国农业科学》 北大核心 2025年第5期1032-1042,共11页
【目的】通过建立检测胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)的夹心ELISA方法,进行猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)灭活疫苗研制中抗原含量的测定。【方法】以LI为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗LI多克隆抗体;... 【目的】通过建立检测胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)的夹心ELISA方法,进行猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)灭活疫苗研制中抗原含量的测定。【方法】以LI为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗LI多克隆抗体;同时免疫6周龄BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备抗LI单克隆抗体。用Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)对制备的抗体进行鉴定。将单克隆抗体作为捕获抗体,多克隆抗体作为检测抗体,建立检测LI的夹心ELISA方法,优化反应条件,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价。用优化后的检测方法对灭活后的LI进行定量检测。【结果】制备的多克隆抗体效价达1:409600。经三轮亚克隆后共筛选出3株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1B7、3C7、4F10,腹水效价均为1:204800。3株单克隆抗体均与LI发生特异性反应,与肠致病性大肠杆菌(E.coli O157:H7)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis,S.Choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typhimurium)均无交叉反应。夹心ELISA方法经优化后条件为:捕获抗体为4F10;捕获抗体与检测抗体的工作浓度分别为1.25和0.625μg·mL^(-1);包被液为磷酸盐缓冲液,包被条件为4℃14 h;封闭液为1%明胶,封闭条件为37℃1.5 h;抗原孵育条件为37℃1 h;检测抗体孵育条件为37℃0.5 h;酶标抗体稀释度为1:16000,孵育条件为37℃1.5 h;显色条件为室温孵育10 min。该方法对其他常见的肠道病原菌检测均为阴性,对LI的最低检测限为1×10^(5)个/mL,且批内、批间变异系数均小于10%。LI浓度在1×10^(5)—1×10~8个/mL范围内与P/N值呈线性关系,标准方程:y=2.7349x-11.643(R^(2)=0.9966)。使用该方法对该实验室制备的PPE灭活疫苗进行抗原定量,结果显示灭活前后抗原含量基本不变,且两组疫苗样品定量结果批内重复性良好。120份猪临床粪便样品检测结果显示,用夹心ELISA方法共检出62份阳性样品,58份阴性样品;用巢式PCR方法共检出67份阳性样品,53份阴性样品。二者的阳性符合率为86.6%,阴性符合率为92.5%,总符合率为89.2%,kappa值为0.78。【结论】成功制备针对LI的多克隆抗体与单克隆抗体,建立并优化了检测LI抗原的夹心ELISA检测方法。该方法特异性与重复性良好,对LI的检测限为1×10^(5)个/mL。可用于PPE灭活疫苗制备过程中抗原的定量检测及PPE临床样品的检测。 展开更多
关键词 胞内劳森菌 单克隆抗体 夹心elisa 抗原定量
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猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
11
作者 曾苗苗 杨小曼 +9 位作者 张鑫 刘大凯 时洪艳 张记宇 张燎原 陈建飞 冯廷帅 李修文 石达 冯力 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第1期319-326,共8页
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用... 为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) N蛋白 原核表达 间接elisa
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猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 邵永恒 倪民婷 +6 位作者 高梦玲 汤娇 张耕馨 林圣宇 刘光亮 陈佳宁 王雯慧 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期883-889,共7页
旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该... 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 VP1蛋白 原核表达 间接elisa
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猪副流感病毒5型HN蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
13
作者 倪民婷 张耕馨 +3 位作者 孙普 刘光亮 陈佳宁 王金涛 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期52-57,共6页
为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔... 为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔包被抗原,10%BSA封闭30 min,1∶400稀释待检血清,1∶10000稀释二抗孵育30 min,显色5 min为最佳反应条件,该方法与猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等阳性血清均无交叉反应,特异性好,PPIV5阳性血清最低检测稀释度为1∶800,敏感性高,批内和批间的变异系数均小于5%,重复性好。表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPIV5的血清学诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪副流感病毒5型 HN蛋白 原核表达 间接elisa
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基于Stefin抗原兔豆状囊尾蚴病间接ELISA检测方法的建立
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作者 王由森 石正发 +6 位作者 车亮 张月玥 羊倩倩 李甲 肖琴 孙晓林 王泽祥 《甘肃农业大学学报》 北大核心 2025年第1期1-9,共9页
【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包... 【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包被条件、封闭条件、血清稀释度、酶标二抗稀释度、反应时间、温度等条件,以阳性血清与阴性血清的D_(450 nm)比值(P/N)作为判断标准优化反应条件,并对ELISA方法的敏感性、特异性、重复性进行检测。【结果】测定了重组蛋白浓度。间接ELISA检测方法临界值为0.352。阳性血清稀释倍数至1∶12800时,D_(450 nm)的值仍大于临界值。兔球虫、兔弓形虫等阳性血清检测显示D_(450 nm)均小于0.352。【结论】Stefin蛋白可以大批量获得,以stefin作为抗原建立的间接ELISA检测方法可以应用于豆状囊尾蚴病的诊断和流行病学调查研究,对豆状囊尾蚴病的有效防控具有重要的意义。 展开更多
关键词 豆状囊尾蚴 BRADFORD 间接elisa Stefin
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基于真核表达塞内卡病毒A VP2蛋白的间接ELISA检测方法
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作者 裴宗飞 于凯蓝 +2 位作者 安欣娜 陈俊雯 张永宁 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2025年第1期65-74,共10页
为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2... 为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2蛋白。以纯化的VP2蛋白为包被抗原,利用棋盘滴定法确定最优的抗原包被浓度和待检血清稀释度,通过优化反应条件和确定临界值,建立了检测SVA抗体的间接ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及与IFA的检测符合率。结果显示,重组VP2蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞内呈现可溶性表达,能够被SVA VP2特异性单克隆抗体2F5识别;经Ni-NTA纯化后,获得了分子量约31 kDa的重组VP2蛋白;间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.287;与口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型抗血清无交叉反应;批内与批间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA检测了实验室保存的52份猪血清样本,与IFA的检测符合率为96.15%(50/52)。综上,本试验间接ELISA的成功建立为SVA抗体检测和流行病学调查提供了有力工具。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A(SVA) VP2蛋白 昆虫杆状病毒表达系统 间接elisa 抗体
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牛多杀性巴氏杆菌OmpA抗原间接ELISA方法的建立
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作者 王润清 孙航 +4 位作者 孙雨 李歌 李琦 侯晓林 阚威 《中国动物检疫》 2025年第2期87-94,共8页
为建立一种快速检测牛多杀性巴氏杆菌的方法,分析多杀性巴氏杆菌OmpA序列信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pET32a载体上,构建相应的重组质粒pET32a-OmpA;将重组质粒转化... 为建立一种快速检测牛多杀性巴氏杆菌的方法,分析多杀性巴氏杆菌OmpA序列信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pET32a载体上,构建相应的重组质粒pET32a-OmpA;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞株中,经扩大培养成功诱导表达出了纯度较高的包涵体OmpA蛋白,将OmpA重组蛋白作为诊断抗原,经反应条件优化建立了间接ELISA抗体检测方法。经试验验证,该方法对其他相关的牛类病原无交叉反应,阳性血清稀释度为1:256时仍呈阳性,组内与组间变异系数均低于10%。结果表明,该方法特异性与敏感性较好,且具有良好的重复性与稳定性。本研究为进一步开发成熟的牛多杀性巴氏杆菌抗体检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 牛多杀性巴氏杆菌 OmpA蛋白 原核表达 蛋白纯化 elisa
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猫杯状病毒VP1蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 姬晶晶 王彬 +3 位作者 何昭群 李嘉豪 单衍可 刘斐 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第3期87-94,共8页
旨在建立一种灵敏、准确、高通量检测猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)抗体的间接ELISA方法。本研究通过优化表达条件,在大肠杆菌中表达FCV的VP1蛋白,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化和透析复性,通过SDS-PAGE和Western blot验证... 旨在建立一种灵敏、准确、高通量检测猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)抗体的间接ELISA方法。本研究通过优化表达条件,在大肠杆菌中表达FCV的VP1蛋白,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化和透析复性,通过SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白;以重组VP1蛋白为包被抗原建立检测FCV抗体的间接ELISA方法,通过方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释度,优化抗原包被条件、样品孵育时间、封闭液种类等条件,并对其性能进行验证。结果:表达的目的蛋白条带清晰、大小正确,与FCV阳性血清具有良好的反应性,建立的间接ELISA方法检测6份FCV阴性血清,猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)阳性血清,猫疱疹病毒(feline herpesvirus, FHV)阳性血清均为阴性,对FCV阳性血清的最低检出效价可达1∶10 240,组间与组内变异系数均小于10%,与商品化试剂盒相比符合率达100%。综上,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、重复性和符合率,与其他猫常见病毒阳性血清不发生交叉反应,可以用于临床样品的检测,为FCV感染的诊断、防控、疫苗免疫效力评价提供了技术手段。 展开更多
关键词 猫杯状病毒VP1蛋白 原核表达 间接elisa
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基于ORF2蛋白的山羊星状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用
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作者 于皓同 马永杰 +4 位作者 王凯茸 丁雨欣 张淑霞 张琪 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期17-22,共6页
为了建立山羊星状病毒(Caprine astrovirus)的血清抗体检测方法,从经RT-PCR检测星状病毒阳性的腹泻羊粪便中克隆山羊星状病毒ORF2基因并构建表达载体,用原核表达技术制备重组ORF2蛋白,重组蛋白纯化复性后作为包被抗原,建立山羊星状病毒... 为了建立山羊星状病毒(Caprine astrovirus)的血清抗体检测方法,从经RT-PCR检测星状病毒阳性的腹泻羊粪便中克隆山羊星状病毒ORF2基因并构建表达载体,用原核表达技术制备重组ORF2蛋白,重组蛋白纯化复性后作为包被抗原,建立山羊星状病毒血清抗体间接ELISA检测方法,并对临床收集的山羊血清样本进行检测。结果显示,ORF2重组蛋白大小为42 ku,Western blot证明其具有良好的反应原性;ELISA检测方法最佳工作条件为6μg/mL抗原包被酶标板,一抗血清稀释倍数为1∶100,酶标二抗稀释倍数为1∶5000,阴阳临界值为0.327。用该方法对山羊流产衣原体、立克次体、山羊支原体山羊肺炎亚种及伪结核棒状杆菌的阳性血清进行检测,结果均为阴性;当阳性血清稀释至1024倍时检测结果仍为山羊星状病毒抗体阳性;批内、批间变异系数均小于10%。用该方法对陕西省部分羊场收集到的288份血清样本进行检测,山羊星状病毒抗体阳性率为59.03%。建立了一种检测山羊星状病毒抗体的间接ELISA检测方法,为山羊星状病毒感染的诊断和流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 山羊星状病毒 ORF2蛋白 原核表达 间接酶联免疫吸附试验
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一株牛肠病毒F型的全基因组分析及抗体检测间接ELISA方法的建立
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作者 刘健 于泽海 +5 位作者 张玫瑜 李丹 王君 刘芳琴 张群 徐守振 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期814-825,共12页
本研究从牛肠病毒(BEV)阳性粪便中通过接种BHK细胞进行蚀斑纯化分离得到一株F型肠道病毒,经过RT-PCR鉴定正确后送生物公司进行全基因测序以及进行TCID_(50)的测定,以MEGA11.0等生物信息学软件对BEV全基因进行分析并构建遗传进化树。以... 本研究从牛肠病毒(BEV)阳性粪便中通过接种BHK细胞进行蚀斑纯化分离得到一株F型肠道病毒,经过RT-PCR鉴定正确后送生物公司进行全基因测序以及进行TCID_(50)的测定,以MEGA11.0等生物信息学软件对BEV全基因进行分析并构建遗传进化树。以原核表达方式得到含BEV分离株VP3基因的重组蛋白,作为包被抗原,建立检测抗体的间接ELISA方法,并对建立的ELISA方法的特异性、灵敏性、重复性进行测定与用于临床样品的检测。结果显示,BEV分离株的TCID 50为10-6.26·mL^(-1),病毒分离株全长为7439 nt,ORF大小为6504 bp,编码2168个氨基酸,与F型肠道病毒BEV4遗传关系最近且核苷酸相似性最高,故分离到的病毒为F型肠道病毒,暂命名为BEV-QD,与其他F型毒株相比,BEV-QD株存在氨基酸的突变以及缺失并且大多集中在P2、P3区。本次建立的抗体检测间接ELISA方法重复性良好;阳性血清稀释1600倍后结果仍呈现阳性,灵敏性良好;与BVDV等阳性血清不发生特异性结合,特异性良好;检测40份临床样品中,13份为阳性,阳性率为32.5%。本研究分离到一株F型牛肠病毒突变株,建立了一种抗体间接ELISA方法。为牛肠病毒的检测和防控提供了基础手段。 展开更多
关键词 牛肠道病毒 分离鉴定 TCID_(50) 全基因组分析 elisa
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口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 张芳源 杜文琪 +2 位作者 杨大为 李桂梅 单虎 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期82-90,共9页
为建立口蹄疫病毒(FMDV)快速、高效的血清学检测方法,根据GenBank收录的FMDV-O型国内流行株VP1基因(GenBank登录号:JN998085.1),构建重组质粒pCold TF-VP1,通过原核表达系统获得VP1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达和反应... 为建立口蹄疫病毒(FMDV)快速、高效的血清学检测方法,根据GenBank收录的FMDV-O型国内流行株VP1基因(GenBank登录号:JN998085.1),构建重组质粒pCold TF-VP1,通过原核表达系统获得VP1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达和反应原性后,将纯化后的蛋白作为抗原,建立FMDV抗体间接ELISA方法。结果显示,重组质粒成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,并以可溶性蛋白形式表达。建立的FMDV抗体间接ELISA方法其抗原包被最佳浓度0.5μg/mL,使用1%BSA溶液封闭效果最佳,血清最佳稀释度1∶600,酶标二抗最佳工作浓度1∶8000,且具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与商品化试剂盒比较,符合率为90.2%。本试验在大肠杆菌中成功表达并纯化了FMDV的VP1蛋白,并建立了FMDV抗体间接ELISA方法,为口蹄疫的监测、诊断及试剂盒的开发提供了参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1蛋白 原核表达 间接elisa
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