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重复水高压注射介导hHGF表达载体在小鼠体内的持续高效表达 被引量：1
1
作者 朱传龙 李毓雯 +2 位作者 高人焘 李宜 聂青和 《实用肝脏病杂志》 CAS 2009年第2期81-83,123,共4页
目的构建hHGF表达载体并通过水高压注射法研究hHGF在小鼠体内的持续表达。方法从慢性乙型肝炎患者肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出hHGF基因的cDNA片段,将目的片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的片断酶切回收后插入pcDNA3.1... 目的构建hHGF表达载体并通过水高压注射法研究hHGF在小鼠体内的持续表达。方法从慢性乙型肝炎患者肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出hHGF基因的cDNA片段,将目的片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的片断酶切回收后插入pcDNA3.1质粒,构建真核表达载体pcDNA-hHGF,通过重复水高压注射法将pcDNA-hHGF导入小鼠肝脏,并在首次水高压注射后第0、3、6、9、12、15、18和21天分别收集小鼠血清和肝组织,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测hHGF在小鼠体内的表达情况。结果扩增出了长约2187bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-hHGF中hHGF基因亚克隆至pcDNA3.0载体,酶切鉴定无误;首次水高压注射后不同时间检测外周血和肝脏均有hHGF的高水平表达。结论成功构建了hHGF真核表达载体pCMV-hHGF,重复水高压注射法可将该基因导入小鼠肝脏并获得持续高效的表达。 展开更多
关键词 促肝细胞生长因子 肝脏 水高压注射 基因表达 小鼠
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乙型肝炎病毒急性感染小鼠模型的建立 被引量：11
2
作者 孟忠吉 李磊 +7 位作者 李新宇 张正茂 张振华 田拥军 王宝菊 张珺 雷延昌 杨东亮 《中国病毒学》 CSCD 2005年第6期565-569,共5页
采用高压水注射方法,通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入BABL/cJ小鼠体内,应用real-time PCR、ELISA、RIA、Southern Blot、Northern Blot,以及免疫组化等方法,检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV 抗原表达动态变化、肝组织中HBV... 采用高压水注射方法,通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入BABL/cJ小鼠体内,应用real-time PCR、ELISA、RIA、Southern Blot、Northern Blot,以及免疫组化等方法,检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV 抗原表达动态变化、肝组织中HBV转录和复制情况,以及小鼠免疫应答状况。结果HBV基因可以在小鼠体内表 达和复制,并诱导小鼠产生特异性免疫应答,其应答模式及HBV清除过程与人类的HBV急性感染类似。实验显 示高压注射具有复制能力的HBV质粒可以在小鼠体内建立HBV急性感染模型,这种模型可以用于HBV病毒 学、免疫学以及抗病毒药物筛选等方向的研究。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 动物模型 高压水注射
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血红素加氧酶-1表达对HBV复制的反向调控作用 被引量：3
3
作者 李磊 韩华 +3 位作者 金坤 刘磊 吴晓玲 高人焘 《肝脏》 2013年第10期667-670,679,共5页
目的评价血红素加氧酶-1(HO-1)对HBV复制的调控作用。方法采用分子克隆的方法分别构建人HO-1真核表达载体——pHO和HO-1 RNA干扰质粒pHi,同HBV可复制性克隆pHBV1.3体外共转染人肝癌细胞系Huh-7,检测HBV抗原分泌情况和HBV相关mRNA含量。... 目的评价血红素加氧酶-1(HO-1)对HBV复制的调控作用。方法采用分子克隆的方法分别构建人HO-1真核表达载体——pHO和HO-1 RNA干扰质粒pHi,同HBV可复制性克隆pHBV1.3体外共转染人肝癌细胞系Huh-7,检测HBV抗原分泌情况和HBV相关mRNA含量。利用HBV急性感染小鼠模型,腹腔注射钴原卟啉(CoPP)IX和锌原卟啉(ZnPP)IX分别诱导和抑制HO-1表达,检测血清HO-1水平、HBV效价,免疫组织化学染色观察HBcAg在肝细胞内表达情况。分别在细胞水平和动物体内水平,评价HO-1表达对HBV复制的调控作用。结果同空载体共转染细胞栩比,pHO共转染后HO-1的分泌水平明显上调(P<0.01).HBsAg/HBeAg的分泌受到抑制(均P<0.01);pHi共转染后HO-1的分泌水平下降(P<0.01).而HBsAg/HBeAg分泌增加(P均<0.01);但各组HBV相关RNA水平无明显差异。CoPPIX注射后诱导小鼠血清HO-1高表达(P<0.01),ZnPPIX则有效抑制了HO-1表达(P<0.01)。同对照组相比,CoPPIX组小鼠血清HBV DNA含量降低,肝脏内HBcAg阳性染色信号也随之明显减弱(P均<0.01);而ZnPPIX组小鼠血清HBV DNA含量增加,肝脏内HBcAg表达明显增强(均P<0.01)。结论上调HO-1表达可有效抑制HBV复制,而下调其表达有利于HBV复制,且其可能是在转录后环节上发挥抗HBV作用。 展开更多
关键词 血红素加氧酶1 乙型肝炎病毒 复制 高压水注射 RNA干扰
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HBV感染性克隆长度对其复制能力的影响 被引量：1
4
作者 李磊 嵇小琴 +1 位作者 李宜 高人焘 《肝脏》 2010年第6期417-421,共5页
目的比较不同长度HBV感染性克隆复制能力的差异,为HBV复制相关研究提供依据。方法采用分子克隆的方法体外分别扩增HBV基因组的相应片段,并进行连接,分别构建含1.1、1.2、1.3倍HBV基因组的可复制性克隆。体外转染Huh7细胞系评价抗原分泌... 目的比较不同长度HBV感染性克隆复制能力的差异,为HBV复制相关研究提供依据。方法采用分子克隆的方法体外分别扩增HBV基因组的相应片段,并进行连接,分别构建含1.1、1.2、1.3倍HBV基因组的可复制性克隆。体外转染Huh7细胞系评价抗原分泌和病毒复制情况,使用高压水注射建立急性感染小鼠模型评价病毒分泌情况以及抗原在小鼠肝脏内的表达情况。结果所构建的克隆体外转染Huh-7细胞后均可分泌高浓度的HBsAg,而1.3倍HBV基因组的可复制性克隆HBeAg的分泌能力明显强于其他克隆,转录水平也最高。高压尾静脉注射小鼠后肝组织内均可检测到HBcAg的分布,血清中可以检测到HBV DNA并随时间发生动态变化。其蛋白表达水平和病毒分泌能力均以1.3倍HBV基因组的可复制性克隆较高。结论所构建的克隆在体外及体内均可进行复制,其中含HBV全基因组1.3倍体的可复制性克隆的复制能力最强,可以较好反映来源病毒株的天然复制能力。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 复制 感染性克隆 高压水注射 动物模型
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sH-2K^d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用
5
作者 宋娜 郝友华 +2 位作者 杨新星 丁红晖 杨东亮 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期245-249,共5页
目的:sH-2Kd-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础。方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体。采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小... 目的:sH-2Kd-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础。方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体。采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测。结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05)。显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能。三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同。与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强。高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2Kd-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础。 展开更多
关键词 sH-2Kd-HBc复合物四聚体 抗原的特异性CTL 基因免疫 基因枪 高压水注射
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三种免疫抑制剂对HBV质粒感染小鼠HBV复制的影响
6
作者 黄顺梅 王俊忠 +5 位作者 宋志韬 王宝菊 朱珍妮 朱彬 陆蒙吉 杨东亮 《实用肝脏病杂志》 CAS 2015年第4期348-351,共4页
目的应用小鼠模型评价3种临床常用的免疫抑制剂对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法利用高压水注射法将HBV质粒p AAV/HBV1.2导入Balb/C小鼠肝内,建立小鼠HBV复制模型;将Balb/C小鼠随机分成4组,每组10只,分别给予生理盐水(Saline)、FK50... 目的应用小鼠模型评价3种临床常用的免疫抑制剂对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法利用高压水注射法将HBV质粒p AAV/HBV1.2导入Balb/C小鼠肝内,建立小鼠HBV复制模型;将Balb/C小鼠随机分成4组,每组10只,分别给予生理盐水(Saline)、FK506、DEX和CYP处理。1w后,将供体C57BL/6小鼠皮瓣移植至上述经免疫抑制剂或生理盐水处理的Balb/C小鼠,皮肤移植后继续使用上述免疫抑制剂或生理盐水至观察期结束。采用电化学免疫发光法检测血清HBs Ag、HBs Ab和HBc Ab水平,采用Real-time PCR法检测血清病毒载量。结果FK506、地塞米松和环磷酰胺处理小鼠移植皮瓣的存活时间分别为(21.50±3.09)d、(21.50±3.09)d和(21.40±1.52)d,分别较生理盐水处理组(8.67±1.86)d明显延长[P=0.037、P=0.000和P=0.000];FK506处理组小鼠HBV复制及其抗体产生与对照组无显著性差异,地塞米松处理组在药物处理期间能维持病毒复制,但停药后病毒DNA和HBs Ag迅速下降至检测水平以下,至观察终点仍未检出HBs Ab和HBc Ab阳性,环磷酰胺能明显延长小鼠HBV复制的持续时间,即使在停药后16 w血清HBV DNA和HBs Ag均维持在较高水平,HBc Ab和HBs Ab持续阴性。结论环磷酰胺而非FK506处理可在Balb/C小鼠模型中建立HBV持续复制模型。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 免疫抑制剂 高压水注射 小鼠
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小鼠肝脏导入HBx基因诱导MIG的表达
7
作者 唐莹莹 田德安 +5 位作者 夏雨佳 晏维 张全乐 王伟 常莹 刘梅 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期395-399,共5页
目的将HBx基因转入小鼠肝组织并探讨体内HBx对MIG表达的影响。方法携带HBx的质粒和空载体质粒分别与去唾液酸蛋白体内转染系统(in vivo-jetPEI-Gal system)孵育,形成去唾液酸蛋白受体-聚乙烯亚胺-DNA复合物。将复合物经尾静脉高压注射... 目的将HBx基因转入小鼠肝组织并探讨体内HBx对MIG表达的影响。方法携带HBx的质粒和空载体质粒分别与去唾液酸蛋白体内转染系统(in vivo-jetPEI-Gal system)孵育,形成去唾液酸蛋白受体-聚乙烯亚胺-DNA复合物。将复合物经尾静脉高压注射入小鼠体内,2d后处死小鼠摘取肝脏,采用RT-PCR、免疫组织化学、Western blot法分别检测HBx和MIG的表达。结果空白组和阴性对照组小鼠肝组织无HBx表达,实验组RT-PCR测mRNA表达结果为(1.416±0.025),免疫组化法测定HBx蛋白表达阳性面积率为(35.741±2.245)%,Western blot法检测蛋白表达为(1.357±0.031)(P<0.01)。MIG mRNA在空白组、阴性对照组、实验组中的表达分别为(0.106±0.036)、(0.112±0.027)、(0.238±0.051);免疫组化显示MIG蛋白阳性表达面积分别是(10.157±0.841)%、(11.234±0.627)%、(24.568±3.246)%;Western blot检测结果显示MIG蛋白表达分别为(0.149±0.053)、(0.156±0.042)、(0.349±0.087)。MIG mRNA和蛋白在实验组表达均明显高于空白组和阴性对照组(均P<0.05)。结论去唾液酸蛋白与携带HBx质粒形成去唾液酸-聚乙烯亚胺-DNA复合物,通过尾静脉高压注射法可高效地将HBx基因转入小鼠肝脏组织。而且,转入的HBx基因能有效诱导MIG mRNA和蛋白表达。 展开更多
关键词 HBX MIG 去唾液酸蛋白受体 高压水注射法
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B基因型乙型肝炎病毒感染性克隆的构建及其复制能力评价 被引量：5
8
作者 李磊 张振华 +5 位作者 沈鸿 田拥军 郝友华 王宝菊 赵西平 杨东亮 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期16-20,共5页
目的构建在亚太地区广泛流行的B基因型HBV可复制性克隆，为该基因型相关研究奠定基础。方法采用分子克隆的方法在体外分别扩增HBV基因组的相应片段，并进行连接，构建含1．3倍HBV基因组的可复制性克隆。体外转染Huh7细胞系以评价其抗原... 目的构建在亚太地区广泛流行的B基因型HBV可复制性克隆，为该基因型相关研究奠定基础。方法采用分子克隆的方法在体外分别扩增HBV基因组的相应片段，并进行连接，构建含1．3倍HBV基因组的可复制性克隆。体外转染Huh7细胞系以评价其抗原分泌和病毒复制的情况，使用高压尾静脉注射建立急性感染小鼠模型以评价体内病毒分泌情况以及肝内抗原表达的情况。结果所构建的克隆体外转染Huh7细胞后可分泌高浓度的HBsAg和HBeAg，并可以检测到明显的转录子和复制中间体。高压尾静脉注射小鼠后肝组织内可检测到HBcAg表达，血清中可以检测到HBVDNA，其水平随时间发生动态变化。结论所构建的克隆在体外及体内均町进行复制，具有良好的复制能力。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 基因型 感染性克隆 高压水注射 动物模型
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