中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定 被引量：4

1

作者 田宗成 张西臣 +2 位作者 李建华 尹继刚 杨举 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期573-575,共3页

从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。... 从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。 展开更多

关键词 蓝氏贾第虫 基因组cDNA克隆 序列测定 贾第虫病毒

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犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达 被引量：3

2

作者 陈丽凤 李建华 +3 位作者 刘全 赵月平 曹利利 张西臣 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期36-40,共5页

目的构建犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体。方法根据GCV基因组(DQ238861)的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件,将绿色荧光蛋白(GFP)基因替换GCV基因部分编码区,构建GCV基因与... 目的构建犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体。方法根据GCV基因组(DQ238861)的转录起始位点、复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件,将绿色荧光蛋白(GFP)基因替换GCV基因部分编码区,构建GCV基因与GFP基因的嵌合体,并置T7启动子之下。用T7 RNA聚合酶体外转录后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体,并用荧光显微镜检测GFP表达情况,间接ELISA测定转染后GFP的表达量。结果构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174,经SacⅠ和NotⅠ双酶切得到约2.0和3.5 kb两条带,与预计值相符。由其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达,其表达量在转染后第1天达高峰(A490=1.8);以后随时间的延长而逐渐下降,14 d后绿色荧光信号基本消失。结论成功构建了犬贾第虫病毒转染载体,为贾第虫细胞基因表达调控的研究提供了方法。 展开更多

关键词 犬贾第虫病毒 转染载体 绿色荧光蛋白

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犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析 被引量：2

3

作者 陈丽凤 李建华 +4 位作者 张西臣 刘全 赵月萍 曹利利 陈超 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期408-411,共4页

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物,以犬贾第虫(长春株)纯培养滋养体总核酸为模板进行RT-PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序,通过BLAST在GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析... 根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物,以犬贾第虫(长春株)纯培养滋养体总核酸为模板进行RT-PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序,通过BLAST在GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒(长春株)基因组全长为6 276bp(DQ238861),编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1 056个氨基酸残基的融合蛋白,这2个阅读框被-1核糖体移码框分开,重叠处有220 nt。基因组中G+C占49.62%。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒(L13218)序列同源性为94.62%,编码的氨基酸同源性为93.50%;与国内人源蓝氏贾第虫病毒(AF525216)序列同源性为98.88%,编码的氨基酸同源性为98.30%。 展开更多

关键词 犬贾第虫病毒 全长CDNA序列 基因组 序列分析

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犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果的研究 被引量：1

4

作者 陈丽凤 李建华 +3 位作者 邹亚学 赵月平 曹利利 张西臣 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期279-284,共6页

目的检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。方法将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型... 目的检测犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对犬贾第虫滋养体核仁功能性蛋白KRR1基因体外转录体切割效率。方法将两端携带反义KRR1基因的锤头状核酶(ribozyme,R酶)插入犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)转染载体中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体:短反义序列,上游及下游均为21个碱基,形成重组质粒KRzS;长反义序列,上游为288个碱基,下游为507个碱基,形成重组质粒KRzL。另设两种阴性对照,即重组质粒TRzL(即R酶两端含虫体反义磷酸丙糖异构酶基因,上游为324个碱基,下游为380个碱基)和重组质粒PKR(即犬贾第虫病毒转染载体中仅有KRR1基因的反义片段而无R酶功能区)。应用荧光实时定量RT-PCR法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因mRNA切割活性。结果KRzS、KRzL转录体对KRR1基因体外转录RNA切割效率分别达到74.0%和81.1%。而PKR对KRR1 mRNA反转录的影响较小,RT-PCR效率仅降低12.0%。TRzL对KRR1 mRNA反转录几乎无影响。结论犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体能进行有效切割,为以后的体内锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供依据。 展开更多

关键词 犬贾第虫病毒 转染载体 锤头状核酶 KRR1蛋白

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人源蓝氏贾第虫病毒GLV1518-2322基因的表达及表达产物抗血清的制备 被引量：1

5

作者 田宗成 张西臣 +2 位作者 李建华 尹继刚 杨举 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2004年第1期5-7,共3页

根据中国人源蓝氏贾第虫病毒 (GLV)全基因组测序结果 ,将其全基因组cDNA上编码贾第虫病毒部分衣壳蛋白的GLV1 5 1 8 2 3 2 2基因克隆到原核表达载体pET 2 8c ( +)上 ,构建了原核表达重组质粒pET 2 8c( +) GLV1 5 1 8 2 3 2 2。SDS PAG... 根据中国人源蓝氏贾第虫病毒 (GLV)全基因组测序结果 ,将其全基因组cDNA上编码贾第虫病毒部分衣壳蛋白的GLV1 5 1 8 2 3 2 2基因克隆到原核表达载体pET 2 8c ( +)上 ,构建了原核表达重组质粒pET 2 8c( +) GLV1 5 1 8 2 3 2 2。SDS PAGE分析表明 ,经IPTG诱导 ,3 2kDa蛋白基因在大肠杆菌BL2 1 (DE3 )pLysS中得到高效表达。以纯化的表达产物为抗原 ,免疫BalB c小鼠 ,同时用病毒粒子免疫BalB c小鼠 ,制备了中国人源蓝氏贾第虫病毒GLV1 5 1 8 2 3 2 2蛋白特异性抗血清 ,ELISA方法测得的纯化蛋白最适抗原包被浓度为1 40 0和病毒粒子抗血清最佳工作浓度为 1 2 0 0。 展开更多

关键词 贾第虫病毒 蓝氏贾第虫 蓝氏贾第虫 基因组

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蓝氏贾第虫病毒体外转录体转染条件的研究

6

作者 刘全 张西臣 +2 位作者 李建华 尹继刚 赵永军 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期329-330,334,共3页

目的　确定蓝氏贾第虫病毒体外转录体电穿孔转染的最佳条件。方法　以不同的电击缓冲液、电压及脉冲时间应用GLV和GFP嵌合体体外转录体电穿孔转染蓝氏贾第虫,测定转染虫体的存活率及GFP表达量。结果　在不同转染条件下GLV和GFP嵌合体体... 目的　确定蓝氏贾第虫病毒体外转录体电穿孔转染的最佳条件。方法　以不同的电击缓冲液、电压及脉冲时间应用GLV和GFP嵌合体体外转录体电穿孔转染蓝氏贾第虫,测定转染虫体的存活率及GFP表达量。结果　在不同转染条件下GLV和GFP嵌合体体外转录体均能成功转染蓝氏贾第虫,且在cytomix缓冲液、10 0 0V/cm、8ms电击条件下,对虫体损伤最小,GFP表达量最高。结论　本试验确定的蓝氏贾第虫病毒体外转录体电穿孔转染最佳条件是电击缓冲液为cytomix缓冲液,电压为10 0 0V/cm、脉冲时间为8ms。 展开更多

关键词 蓝氏贾第虫病毒 电穿孔 绿色荧光蛋白 ELISA

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犬贾第虫携病毒株体外纯培养的建立 被引量：4

7

作者 陈丽凤 李建华 +3 位作者 张西臣 刘全 赵月平 曹利利 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期261-265,共5页

目的培养一携带犬贾第虫病毒的犬贾第虫(Giardiacanis)细胞株。方法用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗过滤法纯化犬贾第虫包囊,经口接种5日龄长爪沙鼠(Merionesunguiculata),8d后于其十二指肠无菌收集犬贾第虫滋养体,置改良的TYI-S-33培养... 目的培养一携带犬贾第虫病毒的犬贾第虫(Giardiacanis)细胞株。方法用蔗糖密度梯度离心-G1耐酸漏斗过滤法纯化犬贾第虫包囊,经口接种5日龄长爪沙鼠(Merionesunguiculata),8d后于其十二指肠无菌收集犬贾第虫滋养体,置改良的TYI-S-33培养基中培养,待滋养体在培养管壁上形成细胞单层后进行传代。同时进行冻存和复苏实验,以及纯度、稳定性、细胞生物学特性、微生物污染等4项指标检测。滋养体经液氮冻融3次后3000×g离心15min,取上清,用磷钨酸负染,透射电镜观察病毒粒子。结果犬贾第虫滋养体接种14d后虫体逐渐适应了培养环境,在培养管壁上形成细胞单层,经上述4项指标检测,证明形成了稳定的犬贾第虫细胞株。电镜观察,见滋养体内有外观球形呈20面体结构、直径约为36nm的病毒样粒子。结论建立了携带GCV的犬贾第虫细胞株的体外纯培养。 展开更多

关键词 犬贾第虫病毒 体外培养 改良TYI-S-33培养基

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犬贾第虫dsRNA病毒的鉴定及特性 被引量：3

8

作者 喻建军 张西臣 +4 位作者 何宏轩 李建华 尹继刚 杨举 田宗成 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期475-478,共4页

对分离到的 6株犬贾第虫 ( Giardia canis)包囊进行核酸分析 ,在其中 1株犬贾第虫核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到 1条长度约 7.0 kb的片段。经鉴定 ,该核酸不能被 DNA酶 ( 1 0 0 mg/ L)降解 ,对质量浓度低的 RNA酶 ( 0 .1 mg/ L)不敏... 对分离到的 6株犬贾第虫 ( Giardia canis)包囊进行核酸分析 ,在其中 1株犬贾第虫核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到 1条长度约 7.0 kb的片段。经鉴定 ,该核酸不能被 DNA酶 ( 1 0 0 mg/ L)降解 ,对质量浓度低的 RNA酶 ( 0 .1 mg/ L)不敏感 ,但可被质量浓度高的 RNA酶 ( 1 0 mg/ L)降解。纯化包囊经液氮冻融后 ,磷钨酸负染 ,电镜观察发现有球形、直径约为 33nm的病毒样粒子存在 ,包囊超薄切片在胞质中也观察到该病毒样粒子存在。RNA依赖 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有 RNA依赖 RNA聚合酶的活性。犬贾第虫 ds RNA病毒核酸经 RT-PCR扩增后得到 1条预计扩增大小的片段 ,将其回收后连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆并测序 。 展开更多

关键词 犬贾第虫 贾第虫病毒 鉴定 犬

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人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析 被引量：4

9

作者 田宗成 张西臣 +2 位作者 李建华 尹继刚 杨举 《热带医学杂志》 CAS 2002年第1期5-8,共4页

目的　从我国蓝氏贾第虫 (Giardialamblia)中寻找贾第虫病毒。方法　对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养 ,将其总核酸电泳 ,并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT PCR ,将产物回收后连接... 目的　从我国蓝氏贾第虫 (Giardialamblia)中寻找贾第虫病毒。方法　对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养 ,将其总核酸电泳 ,并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT PCR ,将产物回收后连接到Pmd18 T载体上进行克隆并测序 ,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索。结果　在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约 7 0kb的片段。该核酸不能被DNA酶 (10 0 μg/ml)降解。但可被RNA酶 (10 μg/ml)降解。经RT PCR扩增后得到 1条预计 85 6bp的片段 ,所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为 98%。结论　在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒 。 展开更多

关键词 序列分析 贾第虫病毒 克隆

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检测蓝氏贾第鞭毛虫病毒表达的绿色荧光蛋白间接ELISA方法的建立 被引量：2

10

作者 刘全 张西臣 +2 位作者 李建华 尹继刚 赵永军 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第2期85-87,共3页

目的建立蓝氏贾第鞭毛虫病毒(GLV)介导的绿色荧光蛋白(GFP)表达定量检测方法,为GFP在寄生性原虫病毒研究中的应用奠定基础。方法以GFP兔抗血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清为二抗,建立GFP定量检测的间接ELISA方法。结果定量检... 目的建立蓝氏贾第鞭毛虫病毒(GLV)介导的绿色荧光蛋白(GFP)表达定量检测方法,为GFP在寄生性原虫病毒研究中的应用奠定基础。方法以GFP兔抗血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清为二抗,建立GFP定量检测的间接ELISA方法。结果定量检测GFP的间接ELISA方法最适反应条件为以10%正常胎牛血清作为封闭剂,一抗的最佳稀释度为1∶3200,二抗的最佳稀释度为1∶1600。结论以GFP兔抗血清为一抗成功建立GFP定量检测的间接ELISA方法,检测结果能正确反映GLV介导的GFP表达情况。 展开更多

关键词 贾第虫病毒 绿色荧光蛋白 ELISA

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蓝氏贾第鞭毛虫病毒研究进展 被引量：1

11

作者 刘全 张西臣 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2005年第6期464-467,共4页

关键词 蓝氏贾第鞭毛虫 病毒研究 利什曼原虫 贾第虫病毒 阴道毛滴虫 溶组织阿米巴 寄生虫学研究 原虫病毒 病毒样粒子 艾美尔球虫

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蓝氏贾第鞭毛虫PPDK特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建及鉴定 被引量：3

12

作者 曹利静 冯宪敏 +2 位作者 卢思奇 张西臣 王凤云 《寄生虫与医学昆虫学报》 CAS 2008年第1期1-7,共7页

丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvatephos phate dikinase,PPDK)可能是蓝氏贾第鞭毛虫能量代谢中具有催化作用的关键酶桩一。为了进一步探讨该酶在贾第虫能量代谢中的作用,本文采用RNA draw软件分析贾第虫编码PPDK的基因序列并设计特异性反义锤... 丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvatephos phate dikinase,PPDK)可能是蓝氏贾第鞭毛虫能量代谢中具有催化作用的关键酶桩一。为了进一步探讨该酶在贾第虫能量代谢中的作用,本文采用RNA draw软件分析贾第虫编码PPDK的基因序列并设计特异性反义锤头状核酶(Hammerheade ribozyme),克隆该核酶序列并与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建了载有特异性锤头状核酶的贾第虫病毒重组载体pGCV634/H5/2174。该载体经线性化处理后进行体外转录,转录产物以电击方式转染对数生长期的贾第虫滋养体。提取转染后24h虫体总RNA,并以其为模板进行RT-PCR验证转染效果和对靶mRNA的切割效果。结果初步证实了该载体对虫体细胞内编码PPDK的mRNA具有切割作用。 展开更多

关键词 蓝氏贾第鞭毛虫 丙酮酸磷酸双激酶 锤头状核酶 贾第虫病毒

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蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建 被引量：1

13

作者 曹利静 冯宪敏 +3 位作者 魏超君 王凤云 张西臣 卢思奇 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期98-102,138,共6页

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾... 目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH。将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24h的各组虫体。采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析。结果构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH。细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%。细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%。结论重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割。 展开更多

关键词 蓝氏贾第鞭毛虫 犬贾第虫病毒 锤头状核酶 丙酮酸激酶

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蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建 被引量：1

14

作者 魏超君 卢思奇 +1 位作者 曹利静 田喜凤 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期321-326,共6页

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选... 目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423)。将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内。提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果。结果成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423;RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用。结论构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因的mRNA具有高效、特异的切割作用。 展开更多

关键词 蓝氏贾第鞭毛虫 贾第素 α-8贾第素 锤头状核酶 犬贾第虫病毒

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