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结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建
1
作者 吴汉霞 张荣波 唐小龙 《科技信息》 2011年第10期I0028-I0028,I0030,共2页
目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶... 目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌(MTB) Ag85B基因 pires质粒 基因重组
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大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达 被引量：1
2
作者 胡子有 漆松涛 +2 位作者 张遐 张兰兰 吴炳义 《生命科学研究》 CAS CSCD 2009年第6期501-504,共4页
提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGF... 提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达. 展开更多
关键词 Μ型阿片受体 巢式PCR pires2-EGFP质粒 HEK293细胞
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pIRES2-EGFP-DAZ3质粒构建及金黄地鼠2-细胞胚中人DAZ基因的复制与表达
3
作者 徐珊珊 黄天华 +2 位作者 谢庆东 吴丛梅 吴德生 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2006年第3期180-184,共5页
背景与目的:人Yq11.2上AZF区(内含DAZ基因家族)的缺失是多数男性不育的病因。本研究旨在探讨DAZ3基因导入精子的可能性以及导入基因在2-细胞胚中的功能。材料和方法:构建pIRES2-EGFP-DAZ3质粒,经鉴定无误后将其导入金黄地鼠精子。将携带... 背景与目的:人Yq11.2上AZF区(内含DAZ基因家族)的缺失是多数男性不育的病因。本研究旨在探讨DAZ3基因导入精子的可能性以及导入基因在2-细胞胚中的功能。材料和方法:构建pIRES2-EGFP-DAZ3质粒,经鉴定无误后将其导入金黄地鼠精子。将携带DAZ3基因的精子与金黄地鼠卵母细胞进行体外受精。用FISH、PCR、RT-PCR技术分别检测DAZ3基因在精子头部、雄原核上的整合以及在2-细胞胚中的复制与表达。结果:构建的pIRES2-EGFP-DAZ3质粒经酶切、PCR和绿色荧光蛋白表达鉴定构建成功。采用FISH在精子头部、单细胞胚雄原核和2-细胞胚两个间期核上观察到阳性杂交信号。采用RT-PCR在2-细胞胚样本中观察到DAZ3cDNA的特异条带。结论:外源性DAZ3基因能被导入精子基因组。携带DAZ3基因的精子可与卵母细胞完成正常的受精过程。导入的DAZ3基因在早期胚胎细胞中能够随细胞分裂自我复制并表达其功能。本研究结果为DAZ基因缺失所致男性不育的治疗提供了新的线索。 展开更多
关键词 人DAZ基因 男性不育 pires2-EGFP-DAZ3质粒复制与表达 金黄地鼠
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EBV-LMP1与HSP90真核双表达质粒的构建及体外表达 被引量：1
4
作者 赵菊梅 刘涛 +2 位作者 田聆 魏于全 文艳君 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期339-343,共5页
目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)与热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核双表达质粒pIRES-LMP1-HSP90β,并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA,逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段,将二者连接于... 目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)与热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核双表达质粒pIRES-LMP1-HSP90β,并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA,逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段,将二者连接于真核双表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1和HSP90β的表达。结果核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该双表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1和HSP90β分子。结论实验所构建的pIRES-LMP1-HSP90β双表达质粒能在体外同时表达LMP1和HSP90β分子。 展开更多
关键词 潜伏膜蛋白1 热休克蛋白90β 真核双表达质粒 质粒pires 鼻咽癌
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pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的导入对减毒沙门菌生物学行为的影响 被引量：2
5
作者 仉元亭 叶建新 +2 位作者 陈卫昌 张学光 任大明 《苏州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2009年第2期236-239,共4页
目的探讨真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入对减毒鼠伤寒沙门菌SL3261生物学行为的影响。方法将真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL通过两步电转化获得含pIRES2-EGFP质粒的SL3261,接种于LB培养基中观察其生长特性、革兰染色观察其形态和... 目的探讨真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入对减毒鼠伤寒沙门菌SL3261生物学行为的影响。方法将真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL通过两步电转化获得含pIRES2-EGFP质粒的SL3261,接种于LB培养基中观察其生长特性、革兰染色观察其形态和血清凝集试验检测其表面抗原变化。利用该重组菌体外感染HepG2细胞,观察其对细胞的侵袭能力的影响。结果含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261在体外生长繁殖较原细菌慢,革兰染色呈阴性丝状菌体,含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261 A-F多价、O4菌体和H1鞭毛抗原和SL3261完全一致;体外感染HepG2能力,SL3261为201±46 CFU/200HepG2细胞,SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,3组间的差异无统计意义(P>0.05)。结论导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒对SL3261的生长和形态有部分影响,而表面抗原以及侵入HepG2细胞的功能不变,该结果为含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒SL3261疫苗菌的进一步研究奠定了实验依据。 展开更多
关键词 pires2-EGFP-4-1BBL质粒 减毒沙门菌 生物学行为
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EBV-LMP1 cDNA克隆与真核表达载体的构建及体外表达
6
作者 赵菊梅 刘涛 +1 位作者 田聆 梁传余 《华西医学》 CAS 2005年第3期426-429,共4页
目的:从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达。方法:利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1cDNA,克隆入pDriveCloningVector并测序,利用引物上设计的酶切位... 目的:从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达。方法:利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1cDNA,克隆入pDriveCloningVector并测序,利用引物上设计的酶切位点NheI和EcoRI将LMP1插入真核表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1的表达。结果:扩增的LMP1cDNA为1301bp,核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1分子。结论:实验所构建的pIRES-LMP1表达质粒能在体外表达LMP1分子。 展开更多
关键词 潜伏膜蛋白1(LMP1) c-DNA克隆 核酸测序 真核表达载体 质粒pires
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稳定表达Syncytin的EL4细胞系的建立及鉴定 被引量：1
7
作者 郑志 牛华 +3 位作者 张桂前 范欣 高玉红 孙鹥 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期205-210,共6页
Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能,我们克隆了人syncytin,并连接到pIRES2-EGFP质粒上,转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行PCR、酶切... Syncytin是人类内源性逆转录病毒W家族的囊膜蛋白。近期研究发现Syncytin与白血病密切相关。为研究Syncytin的生物学功能,我们克隆了人syncytin,并连接到pIRES2-EGFP质粒上,转化该质粒至感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆进行PCR、酶切电泳和DNA测序鉴定,成功构建了表达syncytin基因的真核表达载体。利用罗氏转染试剂转染重组质粒至EL4细胞,并通过G418选择性培养基筛选,在荧光显微镜下观察细胞中Syncytin表达,用RT-PCR、Western blot检测Syncytin表达水平,结果显示我们成功构建了稳定表达人Syncytin的EL4细胞系。稳定表达人Syncytin的EL4细胞系的建立,为进一步研究人Syncytin功能及其与白血病免疫逃逸的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。 展开更多
关键词 Syncytin蛋白 pires2-EGFP质粒 真核表达载体 EL4细胞 白血病
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Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达 被引量：1
8
作者 蔡晓冬 杨炼红 +1 位作者 吕瑞妍 沈庆煜 《热带医学杂志》 CAS 2011年第3期240-242,277,F0003,共5页
目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂... 目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 DNA 质粒pires2-EGFP/Bcl-xl SH-SY5Y细胞 转染 基因表达
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