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人源RNA解旋酶DHX34基因功能结构域缺失载体的构建及鉴定
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作者 黄立敏 张春丽 +2 位作者 李泽雨 孙晋 田红卫 《山西医科大学学报》 2025年第1期20-27,共8页
目的 分别构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体,测序分析和验证其在293T细胞中的蛋白表达。方法 以pECMV-hDHX34-3×FLAG-SV40-Puro(hDHX34)质粒为模板,根据同源重组克隆的技术原理设计不同功能结构域引物,通... 目的 分别构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体,测序分析和验证其在293T细胞中的蛋白表达。方法 以pECMV-hDHX34-3×FLAG-SV40-Puro(hDHX34)质粒为模板,根据同源重组克隆的技术原理设计不同功能结构域引物,通过聚合酶链式反应扩增片段,重组克隆到pECMV-MCS-3×FLAG-SV40-Puro空载上,经限制性酶切、重组、转化分别构建ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔOB、ΔWR载体。经测序验证后,利用脂质体转染293T细胞,Western blot检测各载体蛋白的表达。结果 测序结果与预期结果相符,证实人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的真核表达载体构建成功。核酸电泳结果显示,hDHX34及突变质粒ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR和ΔOB片段长度符合预期,证明质粒构建成功。Western blot结果显示,293T细胞分别转染ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR、ΔOB载体后,蛋白条带清晰可见且符合预期相对分子量,说明质粒转染成功,hDHX34及各突变质粒成功表达。结论成功构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体,并验证了各载体的表达情况,为研究人源DHX34基因的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 RNA解旋酶 DHX34基因 功能结构域缺失 载体构建 重组克隆 限制性内切酶
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基于公共数据库筛选淋巴特异性解旋酶过表达肺腺癌细胞的差异微小RNA及其关键基因对预后的影响
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作者 刘崇梅 曾毅群 +2 位作者 许勇 陈睿鹏 高亚 《癌症进展》 2024年第6期623-629,共7页
目的 分析淋巴特异性解旋酶(LSH)在肺腺癌PC9细胞过表达后微小RNA(miRNA)的表达差异,并预测其潜在调控基因。方法 采用高通量测序技术检测LSH过表达的PC9细胞系中的总miRNA,并筛选核质比有差异的候选miRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应... 目的 分析淋巴特异性解旋酶(LSH)在肺腺癌PC9细胞过表达后微小RNA(miRNA)的表达差异,并预测其潜在调控基因。方法 采用高通量测序技术检测LSH过表达的PC9细胞系中的总miRNA,并筛选核质比有差异的候选miRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对候选miRNA的核质比进行验证,应用生物信息学方法对调控基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析及基因本位(GO)功能富集分析,构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络对miRNA核靶点进行筛选,利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库探究候选靶基因对肺腺癌患者预后的影响。结果 通过对LSH过表达PC9细胞进行测序及基因差异分析,共筛选出5个核质比差异的miRNA:hsa-miRNA-30e-5p、hsa-miRNA-378i、hsa-miRNA-378f、hsa-miRNA-423-5p、hsa-miRNA-4284,其中核内miRNA-4284增加最为显著。经KEGG与GO富集分析发现这些miRNA可能通过结合靶基因参与了RAS信号通路的调控。通过PPI网络及肺癌预后预测发现,差异miRNA可下调CXC趋化因子受体4(CXCR4)表达,增加肺腺癌患者的死亡风险。结论 LSH过表达的肺腺癌PC9细胞核和细胞质中出现多个显著差异表达的miRNA,以核内miRNA-4248变化最为明显,生物信息学分析发现差异miRNA可能通过下调CXCR4的表达增加肺腺癌患者的死亡风险。 展开更多
关键词 肺癌 淋巴特异性解旋酶 微小RNA miRNA-4248 CXC趋化因子受体4
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Ku70作为RNA解旋酶调节miR-124的加工成熟及神经细胞的分化
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作者 黄皑雪 李睿婷 +8 位作者 赵越超 李洁 李慧 丁学锋 王琳 肖参 刘雪梅 秦成峰 邵宁生 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1418-1433,共16页
目的Ku70蛋白主要通过其DNA结合特性参与双链DNA断裂(DSB)的非同源端连接(NHEJ)修复,有报道称其具有RNA结合功能,本文探索Ku70是否具有RNA解旋酶活性并影响miRNA加工成熟。方法利用RNA免疫共沉淀(RIP)测序结合生物信息学分析Ku蛋白结合... 目的Ku70蛋白主要通过其DNA结合特性参与双链DNA断裂(DSB)的非同源端连接(NHEJ)修复,有报道称其具有RNA结合功能,本文探索Ku70是否具有RNA解旋酶活性并影响miRNA加工成熟。方法利用RNA免疫共沉淀(RIP)测序结合生物信息学分析Ku蛋白结合的RNA;蛋白质印迹法(Western blot,WB)结合定量反转录PCR(qRTPCR)检测Ku蛋白与miRNAs的表达关系;生物膜干涉技术(BLI)实验分析Ku蛋白与RNA的结合能力;电泳迁移率变动分析(EMSA)实验确定Ku70及Ku80的RNA解旋酶活性;形态学检测结合WB分析Ku70调节miR-124引起的神经细胞功能变化;免疫荧光结合形态学分析寨卡病毒(ZIKV)感染后Ku70及miR-124的变化与神经元分化关联。结果研究发现,Ku70蛋白具有RNA解旋酶活性,并通过其RNA解旋酶活性影响miRNA加工成熟。Ku70缺失引起许多miRNAs上调,其中包括神经细胞特异的miR-124。在人神经前体细胞(h NPCs)和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中敲低Ku70可促进miR-124的成熟,从而导致上述细胞向神经元分化。本文进一步发现,ZIKV感染影响了Ku70及miR-124的表达,导致细胞形态的分化。结论本研究揭示了Ku70的一种新功能,即Ku70有可能参与miRNA的成熟调控和神经细胞的分化,并且可能是ZIKV病毒致小头症的原因之一。 展开更多
关键词 KU70 RNA解旋酶 miRNA加工成熟 miR-124 神经元分化
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猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶的结构特征与功能研究进展
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作者 韩松 段宏勇 +5 位作者 王树茂 姜一峰 周艳君 童光志 高飞 李丽薇 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1309-1314,共6页
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起猪的接触性传染病,主要症状为妊娠母猪繁殖障碍和各生长阶段猪的呼吸道疾病^([1])。1996年... 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起猪的接触性传染病,主要症状为妊娠母猪繁殖障碍和各生长阶段猪的呼吸道疾病^([1])。1996年,我国首次分离到PRRSV^([2])。2006年,我国暴发高致病性PRRS(Highlypathogenic PRRS,HP-PRRS),该病以高热、高发病率、高死亡率和快速传播为主要特征^([3])。2010年,我国广东省首次报道PRRSV QYYZ-like株^([4]),随年,我国广东省首次报道PRRSV QYYZ后其主要在我国东南部地区流行^([5-6])。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 母猪繁殖障碍 呼吸道疾病 接触性传染病 蓝耳病 我国东南部 高死亡率 解旋酶
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RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤的相关性研究
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作者 武鹏立 刘博 吕洋 《现代肿瘤医学》 CAS 2024年第11期2088-2091,共4页
RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的家族,是基因表达的重要调控因子,在RNA代谢的多个方面发挥作用。RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族既在RNA代谢中具有重要作用,又与人类细胞中基因组的不稳定性直接相关。而基因组的不稳定性是癌... RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的家族,是基因表达的重要调控因子,在RNA代谢的多个方面发挥作用。RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族既在RNA代谢中具有重要作用,又与人类细胞中基因组的不稳定性直接相关。而基因组的不稳定性是癌症克隆进化的驱动因素,能够促进癌症的发生发展。该文对RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤发生发展的相关性做一综述。 展开更多
关键词 DEAD-box蛋白家族 RNA解旋酶 肿瘤 作用机制
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DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用
6
作者 谢立兰 尹杰 +1 位作者 黄冬蛾 李么明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期215-222,共8页
旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量... 旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 DEAD-box解旋酶21 宿主蛋白 病毒复制
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解旋酶样转录因子与消化道肿瘤的关系研究进展
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作者 张校 任亚丽 +2 位作者 黄璐 徐维田 张松 《联勤军事医学》 CAS 2024年第2期171-175,共5页
消化道肿瘤涉及食管、胃肠、肝脏等多个器官,发病率和死亡率居高不下,对人类生命造成严重影响。消化系统的发育始于原肠胚层和中胚层在原肠形成期的定位^([1])。在定位后,原始原肠形成一个肠管,该肠管会被来自周围中胚层的信号进行模式... 消化道肿瘤涉及食管、胃肠、肝脏等多个器官,发病率和死亡率居高不下,对人类生命造成严重影响。消化系统的发育始于原肠胚层和中胚层在原肠形成期的定位^([1])。在定位后,原始原肠形成一个肠管,该肠管会被来自周围中胚层的信号进行模式化,演变为前肠、中肠和后肠区域^([2-6])。消化系统的原胚层来源相似,其中转录因子在消化系统的发育中具有重要作用。转录因子突变和异常表达可能导致消化系统发育的缺陷、基因表达的失调以及信号通路的异常,最终诱导癌症的发生。解旋酶样转录因子(helicase-like transcription factor,HLTF)是交配型转换/蔗糖不发酵(switch/sucrose nonfermentable chromatin-remodeling complex,SWI/SNF)染色质重塑复合物家族的成员,在基因转录、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)修复、基因组稳定性维护和癌症进展中具有重要功能^([7])。HLTF启动子高甲基化与癌症发生发展密切相关,并且在肿瘤细胞的早期阶段时就存在HLTF甲基化^([8])。癌症早期阶段肿瘤细胞会释放DNA或核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)到血液、血清、粪便或脑脊液等体液中,提供了非侵入性癌症检测途径^([9])。HLTF作为反映肿瘤细胞代谢的特异性生物标志物为肿瘤的靶向治疗和早期预测提供了新的靶点。本文将围绕HLTF的结构、功能以及与消化道肿瘤的关系进行综述。 展开更多
关键词 解旋酶样转录因子 消化道肿瘤 转录调控 生物标志物 治疗靶点
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丙型肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定 被引量:2
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作者 雷迎峰 尹文 +6 位作者 薛小平 杨敬 吕欣 韦三华 胡兴斌 孙梦宁 徐志凯 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期40-43,共4页
解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大... 解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot证实系解旋酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化解旋酶。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 解旋酶基因 大肠杆菌 蛋白表达 表达纯化 解旋酶 SDS-PAGE WESTERN 鉴定 反转录PCR
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高等植物中的DNA解旋酶 被引量:3
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作者 初立业 邵宏波 李茂言 《重庆邮电学院学报(自然科学版)》 2005年第4期511-515,共5页
综述了在离体实验条件下高等植物DNA解旋酶在以下多方面具有重要的生物学功能:包括DNA重组、DNA复制、翻译启始、rDNA转录及在pre-rRNA加工过程早期阶段,双链断裂修复、端粒长度维持、核苷酸切除修复、花发育中的细胞分裂/增殖、基因组... 综述了在离体实验条件下高等植物DNA解旋酶在以下多方面具有重要的生物学功能:包括DNA重组、DNA复制、翻译启始、rDNA转录及在pre-rRNA加工过程早期阶段,双链断裂修复、端粒长度维持、核苷酸切除修复、花发育中的细胞分裂/增殖、基因组甲基化方式保持、植物细胞周期和细胞基本生命活动的维持。最近玉米基因组中发现的解旋子(helitron)插入说明高等植物DNA解旋酶可能在植物生长与发育中有重要调控作用。因而有着重要的生物技术应用价值。 展开更多
关键词 高等植物 DNA解旋酶 RNA解旋酶 理化特性 生物功能
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赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望 被引量:12
10
作者 刘洵 程天印 +1 位作者 常小斌 王小君 《长沙大学学报》 2007年第2期29-31,共3页
赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌... 赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景. 展开更多
关键词 解旋酶恒温基因扩增 DNA解旋酶 单链DNA结合蛋白
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赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展 被引量:2
11
作者 陈璐 沈建箴 《医学综述》 2010年第13期1932-1934,共3页
随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原... 随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。 展开更多
关键词 解旋酶恒温基因扩增 DNA解旋酶 单链DNA结合蛋白
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牛DHX36解旋酶及其突变体底物结合与解旋活性研究
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作者 郭青青 郭海磊 +1 位作者 刘娜女 奚绪光 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2021年第5期8-15,23,共9页
【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b... 【目的】研究牛(Bos taurus)解旋酶DHX36(BtDHX36)及其突变体蛋白对含有G4结构底物结合和解旋活性的差异,为深入研究牛DHX36酶学特征和结构提供理论参考。【方法】制备底物16nt-ssDNA、Telomere G4和Telomere G4-16T,构建重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36,通过Overlap PCR引入点突变,构建位于RSM区和OB域的突变重组质粒,分别将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达;经过Ni-NTA和Hi Trap SP HP柱纯化得到目的蛋白。以解离平衡常数为判定指标,利用荧光各向异性法(FA)对酶蛋白与底物结合时的KCl浓度(0,50和100 mmol/L)、反应温度(25,30和37℃)、MgCl 2浓度(0,2和5 mmol/L)、pH(6.5,7.5和8.5)进行优化,确定BtDHX36的体外最佳底物结合条件,比较野生型BtDHX36及其突变体对含有G4结构底物结合活性的差异。以解旋比例和速率常数为判定指标,利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,比较野生型BtDHX36及其突变体对G4结构的解旋活性差异。【结果】成功构建了野生型BtDHX36重组质粒pET15b-sumo-BtDHX36及其RSM区突变体BtDHX36 R63AI65A、BtDHX36 Y69A、BtDHX36 K76AN77AK78A和OB域突变体BtDHX36 Y862A的重组质粒,诱导表达纯化后得到了纯度大于95%的酶蛋白。确定了野生型BtDHX36的体外最佳底物结合条件为:KCl 50 mmol/L、MgCl 22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反应温度37℃。各突变位点均可降低酶蛋白与Telomere G4的结合活性。OB域的Y862A突变和RSM区K76AN77AK78A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T活性均无明显影响;RSM区的R63AI65A和Y69A突变对酶蛋白解旋Telomere G4-16T均有较大影响。【结论】获得了高纯度的野生型BtDHX36及突变体酶蛋白,明晰了其体外最佳底物结合条件;RSM区的R63AI65A和Y69A突变均可明显降低酶蛋白解旋Telomere G4-16T的活性。 展开更多
关键词 解旋酶 DHX36解旋酶 解旋酶突变体 G4底物
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丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶结构和功能的影响 被引量:7
13
作者 段丽霞 许厚强 +1 位作者 陈祥 骆衡 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期467-472,共6页
目的研究体外丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶结构和功能的影响及二者的相互作用机制。方法分别运用荧光偏振技术、ATPase试剂盒和紫外吸收光谱技术分析丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶活性和DNA结合活性、AT-Pase活性和构象的影响。结果丙... 目的研究体外丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶结构和功能的影响及二者的相互作用机制。方法分别运用荧光偏振技术、ATPase试剂盒和紫外吸收光谱技术分析丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶活性和DNA结合活性、AT-Pase活性和构象的影响。结果丙酸睾酮能够影响E.coliRecQ解旋酶的活性。低浓度促进解旋酶活性,高浓度抑制;抑制RecQ解旋酶与dsDNA的结合活性,其抑制常数Ki小于7×10-5 nmol.L-1;对与ssDNA结合活性的Ki为7×10-3 nmol.L-1;对ATPase活性抑制作用的时间相关性较弱;影响RecQ解旋酶的构象变化,但峰位无偏离。结论提示丙酸睾酮与RecQ解旋酶具有弱相互作用,二者具有两个结合位点。 展开更多
关键词 丙酸睾酮 大肠杆菌 RecQ解旋酶 解旋酶活性 DNA结合活性 ATPASE活性 构象
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设计特定序列的引物提高依赖解旋酶恒温扩增效率 被引量:2
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作者 张培培 吴洋 +1 位作者 王玲 齐浩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期747-753,共7页
依赖解旋酶恒温扩增(helicase-dependent amplification,HDA)是一种新型的恒温DNA体外扩增方法,具有反应原理简单,反应温度恒定等优点,被广泛地应用于核酸分子检测。但是依赖解旋酶恒温扩增仍面临着双链DNA解旋反应效率不高导致的扩增... 依赖解旋酶恒温扩增(helicase-dependent amplification,HDA)是一种新型的恒温DNA体外扩增方法,具有反应原理简单,反应温度恒定等优点,被广泛地应用于核酸分子检测。但是依赖解旋酶恒温扩增仍面临着双链DNA解旋反应效率不高导致的扩增效率不够高、灵敏度低的问题。为了进一步提高依赖解旋酶恒温扩增技术中双链DNA模板的解旋效率,在本研究中,5'端带有不同长度不同序列的寡聚核苷酸引物,被用于依赖解旋酶恒温扩增反应,以研究DNA片段的末端序列对依赖解旋酶的双链DNA解旋反应,乃至整个扩增反应效率的影响。结果表明,只有5'端带有poly(A)序列的核酸引物明显促进了扩增反应效率,其中6个A的长度的5'端组成的引物对恒温扩增的促进作用最好,扩增产物比不带任何特定序列的原引物提高了约5.3倍。相比之下,带有poly(AC)或者poly(C)序列的引物,在一定程度上阻碍依赖解旋酶恒温扩增反应效率。因此,本研究证明了特定设计的末端序列,可以提高依赖解旋酶恒温扩增反应效率。 展开更多
关键词 依赖解旋酶恒温扩增 解旋酶 引物设计
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三种癌细胞株中Bloom综合征解旋酶(BLM)的表达水平高于正常细胞 被引量:20
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作者 孟惠惠 许厚强 +1 位作者 刘金河 王时雄 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期649-651,共3页
由于Bloom综合征解旋酶(Bloom’s syndrome helicase,BLM)基因缺陷引起的Bloom综合征(Bloom’s syndrome,BS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,BS患者的临床特征表现为严重的生长迟缓、学习障碍、免疫缺陷等。BLM解旋酶在睾丸和... 由于Bloom综合征解旋酶(Bloom’s syndrome helicase,BLM)基因缺陷引起的Bloom综合征(Bloom’s syndrome,BS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,BS患者的临床特征表现为严重的生长迟缓、学习障碍、免疫缺陷等。BLM解旋酶在睾丸和胸腺中高表达,另一方面,BLM基因的突变和高表达与肿瘤发生相关,如结肠癌、肺癌、白血病等。本研究观察了A549人肺癌细胞、SGC7901人胃癌细胞、PC3人前列腺癌细胞与HL-7702[L-02]人正常肝细胞中,BLM解旋酶在mRNA水平及蛋白水平表达量的差异,为寻找新的特异分子治疗靶点提供依据。 展开更多
关键词 不同癌细胞 BLM解旋酶 表达量 差异
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敲减BLM解旋酶表达增强前列腺癌PC3细胞对丝裂霉素C的敏感性 被引量:11
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作者 吴萍 许厚强 +4 位作者 赵佳福 刘忠伟 段志强 陈福 谌颖莲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期190-197,共8页
丝裂霉素C是一种广谱抗肿瘤抗生素,对多种癌症有抗癌作用,其作用原理可使细胞的DNA发生链间交联,引起DNA双链断裂,阻碍DNA的复制,从而抑制肿瘤细胞分裂。临床上主要用于胃癌、肠癌、肝癌及胰腺癌等消化道癌方面的治疗。本文研究丝裂霉素... 丝裂霉素C是一种广谱抗肿瘤抗生素,对多种癌症有抗癌作用,其作用原理可使细胞的DNA发生链间交联,引起DNA双链断裂,阻碍DNA的复制,从而抑制肿瘤细胞分裂。临床上主要用于胃癌、肠癌、肝癌及胰腺癌等消化道癌方面的治疗。本文研究丝裂霉素C对转染人BLM解旋酶基因(shRNA载体)前后前列腺癌PC3细胞活性的影响。使用前期成功构建的干扰载体转染PC3细胞,在转染48 h后加药,通过荧光定量PCR、MTT法、Transwell小室实验、细胞划痕实验、流式细胞术,分别检测加药12、24、36 h BLM基因的表达量、PC3细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力及凋亡情况的变化。结果显示,敲减BLM基因表达后的PC3细胞相对于正常PC3细胞其增殖能力、侵袭能力和迁移能力能显著被丝裂霉素C抑制,且丝裂霉素C能显著促进其细胞的凋亡,说明BLM基因低表达的前列腺癌细胞对丝裂霉素C更敏感。研究结果为丝裂霉素C在前列腺癌的临床治疗上奠定了理论基础。 展开更多
关键词 丝裂霉素C 前列腺癌细胞 BLM解旋酶 shRNA载体 细胞活性
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应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌 被引量:10
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作者 石琰璟 王建广 +6 位作者 房保海 张健 祝素珍 刘云国 姜英辉 雷质文 杨大伟 《青岛科技大学学报(自然科学版)》 CAS 2011年第1期42-45,共4页
以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·... 以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 检测 依赖解旋酶DNA恒温扩增技术
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单核细胞增生李斯特氏菌依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法的建立 被引量:8
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作者 王建广 雷质文 +7 位作者 石琰璟 付静芸 祝素珍 房保海 姜英辉 刘云国 张健 杨大伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期130-132,共3页
为建立单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法,本研究以Lm的iap基因为目的片段设计特异性引物,建立了可在65℃恒温扩增快速(90 min)检测Lm的HDA检测方法,分别对反应体系中的MgAc2、Bst聚合酶、UvrD解旋酶、dN... 为建立单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法,本研究以Lm的iap基因为目的片段设计特异性引物,建立了可在65℃恒温扩增快速(90 min)检测Lm的HDA检测方法,分别对反应体系中的MgAc2、Bst聚合酶、UvrD解旋酶、dNTPs以及引物等的浓度进行优化,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明,所建立起的检测法最低检测限为7.8×103 cfu/mL,灵敏度与普通PCR方法相当。Lm的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 单核细胞增生李斯特氏菌 检测 依赖解旋酶DNA恒温基因扩增
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甘草次酸对Bloom解旋酶生物学特性的影响 被引量:11
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作者 刘金河 许厚强 +1 位作者 孟惠惠 罗霂榃 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期919-926,共8页
甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草主要活性组分,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长.然而,其对BLM解旋酶的抑制作用尚未见报道.本文注视甘草次酸对BLM解旋酶构象、二级结构和生化活性的影响.圆二色光谱和紫外光谱分析显示,GA... 甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草主要活性组分,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长.然而,其对BLM解旋酶的抑制作用尚未见报道.本文注视甘草次酸对BLM解旋酶构象、二级结构和生化活性的影响.圆二色光谱和紫外光谱分析显示,GA可破坏BLM642-1290解旋酶α-螺旋结构,改变其构象,并具有2个结合位点.采用荧光偏振技术和自由磷检测证明,GA以浓度依赖的方式抑制BLM642-1290解旋酶与底物dsDNA及ssDNA的结合,抑制BLM642-1290解旋酶活性及ATP酶活性,且抑制类型为混合抑制.综上所述,本文证明GA可通过结合BLM解旋酶,改变BLM解旋酶构象,抑制BLM解旋酶与DNA的结合,从而抑制BLM解旋酶的生化活性.我们的发现将对深入认识GA的抗肿瘤作用有新的启示. 展开更多
关键词 甘草次酸 BLM解旋酶 生化活性 构象 二级结构 圆二色谱 荧光偏振
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洛美沙星对Bloom综合征解旋酶生物学特性影响的机理研究 被引量:4
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作者 骆衡 陈祥 +2 位作者 丁玫 杨齐心 许厚强 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1060-1071,共12页
Bloom综合征解旋酶(BLM)是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合征.Bloom综合征是一种罕见隐性常染... Bloom综合征解旋酶(BLM)是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合征.Bloom综合征是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者遗传不稳定,并易患多种类型癌症.洛美沙星(LMX)可以抑制细胞内多种酶,并通过结合DNA干扰DNA代谢,从而治疗多种疾病,但是其具体的作用机理还未完全清楚.运用荧光偏振技术和自由磷检测技术,研究了LMX对BLM642~1290解旋酶DNA结合活性、解链活性和ATP酶活性的影响.运用荧光及紫外吸收光谱法研究了LMX与解旋酶结合的结合常数、结合位点数、作用力类型、结合距离等参数.结果表明,LMX与解旋酶之间能自发进行反应,两种分子有一个结合位点,通过静电引力和疏水作用力形成稳定的BLM-LMX复合物,且解旋酶的内源荧光被LMX静态猝灭,主要原因是非辐射能量转移.在这一过程中,LMX能抑制解旋酶的解链活性和ATP酶活性,而促进解旋酶的DNA结合活性.LMX对BLM解旋酶生物学活性影响的机理可能是LMX使解旋酶通过别构机制影响其ATP酶活性,并使酶的构象维持在较低解链活性的状态,通过抑制ATP催化水解与解链过程的偶联和阻止解旋酶的易位,从而抑制其解链.LMX能够促进解旋酶的DNA结合活性,可能是因为其C-6和C-7上的取代功能基团可以增加酶活力,以及增强药物、酶和DNA的结合,从而形成药物-酶-DNA复合物.这些结果为研究以DNA解旋酶为药物靶标的分子机理和理解喹诺酮类药物的作用机理奠定相关理论基础. 展开更多
关键词 洛美沙星 BLM解旋酶 生物学特性 机理
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