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荧光聚合酶链反应–毛细管电泳法与Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶基因启动子突变状态对比分析 被引量：1
1
作者 熊艳蕾 王雷明 +5 位作者 刘莉 王玮 胡泽良 姚盈盈 段焕利 滕梁红 《北京医学》 CAS 2022年第3期245-248,共4页
目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致... 目的对比分析荧光聚合酶链反应-毛细管电泳(polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE)法及Sanger测序法检测胶质瘤中端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因启动子突变的敏感度、特异度及一致性,为临床检测提供方法学依据。方法收集2017年11月至2019年11月首都医科大学宣武医院265例胶质瘤标本及临床病理资料,分别采用Sanger测序法与荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变。结果TERT基因启动子突变与年龄、组织学分型和WHO分级均显著相关(P<0.05)。Sanger测序法与荧光PCR-CE法的TERT基因启动子突变检出率分别为52.8%(140/265)及51.3%(136/265),敏感度和特异度分别为96.4%和99.2%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.955)。Sanger测序法检出TERT C228T突变103例(38.9%),荧光PCR-CE法检出99例(37.4%),敏感度和特异度分别为95.2%和99.4%,符合率为97.7%,具有较好一致性(Kappa=0.952)。Sanger测序法和荧光PCR-CE法均检测出TERT C250T突变37例(14.0%),符合率为100.0%,具有较高一致性(Kappa=1.000)。结论荧光PCR-CE法检测TERT基因启动子突变率与Sanger测序法相当,敏感度、特异度及一致性均较高,且操作相对简便快速。 展开更多
关键词 胶质瘤 端粒酶反转录酶基因启动子突变 荧光聚合酶链反应-毛细管电泳法 Sanger测序法
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胃癌形成过程中端粒酶反转录酶基因表达及启动子甲基化状态分析 被引量：1
2
作者 申去非 徐晋珩 +1 位作者 赵建业 王正晖 《新乡医学院学报》 CAS 2013年第1期16-19,共4页
目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组... 目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组织样本中hTERT基因表达的阳性率;用亚硫酸氢盐修饰上述各组标本DNA,然后检测修饰后的hTERT序列:启动子区CpG位点,未发生甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U);在启动子区不含CpG位点的位置,进行引物设计,然后利用PCR进行扩增。扩增产物序列与原序列比对,观察启动子区甲基化情况。结果 hTERT基因在胃癌组表达的阳性率最高,在癌前病变组表达的阳性率明显降低,而在正常胃黏膜组中不表达,3组组织样本hTERT表达阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。hTERT启动子区甲基化程度在胃癌组中最高,在胃癌前病变组中明显降低,而在正常胃黏膜中甲基化程度最低,3组组织样本hTERT启动子区甲基化程度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERT启动子区甲基化程度在正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌中依次升高,故hTERT启动子区甲基化程度的变化可作为胃癌形成过程中肿瘤早期诊断的潜在分子生物学标志。 展开更多
关键词 胃癌 端粒酶反转录酶 癌前病变 启动子 甲基化
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端粒酶反转录酶启动子突变在甲状腺癌中的研究进展 被引量：2
3
作者 张磊 李小毅 《癌症进展》 2015年第4期391-395,456,共6页
端粒是人染色体中控制细胞增殖的重要结构,端粒酶的持续表达,肿瘤细胞可以维持端粒的长度并获得无限增殖的能力。端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶重要的活性部分。已有研究证实在甲状腺癌中存在TERT启... 端粒是人染色体中控制细胞增殖的重要结构,端粒酶的持续表达,肿瘤细胞可以维持端粒的长度并获得无限增殖的能力。端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶重要的活性部分。已有研究证实在甲状腺癌中存在TERT启动子区突变,这些突变可能与甲状腺癌的不良预后相关,本文全面综述端粒酶反转录酶启动子在不同类型的甲状腺癌中的突变情况及其意义的最新研究,以为甲状腺癌分子水平的诊治提供思路。 展开更多
关键词 甲状腺癌 端粒酶反转录酶 启动子突变 预后
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端粒酶反转录酶启动子突变在肿瘤发生中的研究进展 被引量：5
4
作者 刘浚坤 刘俊文 《医学综述》 2016年第14期2755-2758,共4页
端粒酶催化端粒延长能维持染色体组的完整性,是肿瘤发生的重要生物学标志。端粒酶反转录酶(TERT)是端粒酶中的催化亚单位,其活性在多数体细胞中受到抑制,在肿瘤细胞中TERT基因过表达的确切机制尚不清楚。在黑色素瘤细胞中存在TERT启动... 端粒酶催化端粒延长能维持染色体组的完整性,是肿瘤发生的重要生物学标志。端粒酶反转录酶(TERT)是端粒酶中的催化亚单位,其活性在多数体细胞中受到抑制,在肿瘤细胞中TERT基因过表达的确切机制尚不清楚。在黑色素瘤细胞中存在TERT启动子突变,且具有较高的复现率。另外,TERT启动子突变还广泛存在于神经胶质瘤等多类肿瘤中,可激活TERT,且与肿瘤的恶性程度密切相关。 展开更多
关键词 肿瘤 端粒 端粒酶反转录酶 启动子 突变
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榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响 被引量：9
5
作者 范钰 张尤历 李华 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2006年第5期413-415,共3页
目的:观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶(hTERT)表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法:以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用... 目的:观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶(hTERT)表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法:以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2 h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48 h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果:榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论:榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。 展开更多
关键词 榄香烯乳 胃肿瘤 端粒酶 人端粒酶反转录酶 启动子
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人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究 被引量：2
6
作者 李帆 谭晓华 +2 位作者 彭晓君 蔡红兵 胡大荣 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期207-211,共5页
目的克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体... 目的克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果成功克隆hTERT上游-280bp^+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。 展开更多
关键词 肿瘤 HTERT启动子 GCV 调控 表达 人端粒酶反转录酶 特异性杀伤 克隆 目的基因 LACZ基因
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鸡端粒酶反转录酶启动子区克隆及序列分析
7
作者 邹亚学 孙莹 +2 位作者 潘风光 郑梅竹 张玉静 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期499-502,共4页
根据GenBank(AY505015)报道的鸡端粒酶反转录酶序列设计了1对特异性引物,以鸡淋巴瘤细胞(MDCC-MSB1)总核酸为模板进行PCR。PCR产物连接到pMD19-T载体进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结... 根据GenBank(AY505015)报道的鸡端粒酶反转录酶序列设计了1对特异性引物,以鸡淋巴瘤细胞(MDCC-MSB1)总核酸为模板进行PCR。PCR产物连接到pMD19-T载体进行测序,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索,并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得MDCC-MSB1启动子区全长为997 bp,其中G+C占50.78%。与国外报道的端粒酶反转录酶(AY505015)启动子区序列同源性为99.22%。与人端粒酶反转录酶启动子区相比:二者在起始密码子之前约250 bp均有1个E-box,但在chTERT启动子区新增加了4个c-Myb位点,而3个c-Ets2和WT1位点缺失,其他基序二者的分布基本相似。二者启动子区富含CpG岛,延伸到编码区。 展开更多
关键词 鸡端粒酶 反转录酶 启动子区 转录因子结合基序
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甲状腺乳头状癌端粒酶逆转录酶启动子突变的临床及超声特征分析
8
作者 张宏 钱林学 +1 位作者 刘冬 邱兰燕 《中国医学装备》 2023年第7期85-90,共6页
目的:探索与端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变相关的特征性甲状腺乳头状癌(PTC)的超声特征。方法:选取医院收治的552例术后诊断为PTC患者,依据术后分子学检测将其分为TERT组(19例,TERT启动子突变)和BRAF基因组(533例,单纯BRAF基因突变)... 目的:探索与端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变相关的特征性甲状腺乳头状癌(PTC)的超声特征。方法:选取医院收治的552例术后诊断为PTC患者,依据术后分子学检测将其分为TERT组(19例,TERT启动子突变)和BRAF基因组(533例,单纯BRAF基因突变)。根据术后病理确定淋巴结转移和脉管转移的情况,超声采集结节最大径线、结节数量、回声、边缘、成分、方位、微钙化及桥本氏甲状腺炎背景等特征。比较两组TERT启动子和BRAF基因的突变率和淋巴结转移及脉管转移的发生率;将两组有差异的临床和超声特征进行Logistic回归分析,分析与TERT启动子突变的相关危险因素。结果:552例患者平均年龄为(45.39±12.39)岁,TERT组患者的平均年龄为(57.42±12.41)岁,高于BRAF基因组患者的平均年龄(44.96±12.18)岁,差异有统计学意义(t=4.378,P<0.05),TERT组中≥45岁的患者占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(48.2%),差异有统计学意义(x^(2)=6.931,P<0.05)。TERT组中有36.8%的患者发生侧颈区淋巴结转移,明显高于BRAF基因组(8.1%),差异有统计学意义(x^(2)=18.985,P<0.05)。TERT组的结节最大径(2.50±1.88)cm明显大于BRAF基因组的结节最大径(1.02±0.64)cm,差异有统计学意义(t=3.406,P<0.05)。TERT组>1 cm的结节占比(78.9%)明显高于BRAF基因组(32.7%),差异有统计学意义(x^(2)=17.655,P<0.05),TERT组中囊实性结节的占比(10.5%)明显高于BRAF基因组(1.1%),差异有统计学意义(x^(2)=11.351,P<0.05)。TERT组中73.7%的患者结节距离被膜<2 mm,明显高于BRAF基因组,差异有统计学意义(x^(2)=4.621,P<0.05)。Logistic回归分析显示,相对于BRAF基因组,年龄≥45岁、结节最大径>1 cm和结节成分呈囊实性是与TERT启动子突变相关的独立危险因素(OR=3.895,OR=6.442,OR=7.929;P<0.05)。结论:在结节有垂直位、微钙化、边缘不规则等恶性征象的基础上,当患者年龄≥45岁、结节>1 cm和结节成分呈囊实性时应考虑存在TERT启动子突变的可能。 展开更多
关键词 端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变 BRAF基因突变 侵袭性 甲状腺乳头状癌(PTC) 超声特征
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人端粒酶反转录酶启动子调控的肿瘤特异性载体的构建及表达
9
作者 侯睿 金鑫 李和 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2013年第2期189-193,共5页
目的构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的绿色荧光蛋白质粒。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒(hTERTp-EGFP)。用脂质... 目的构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的绿色荧光蛋白质粒。方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒(hTERTp-EGFP)。用脂质体转染法将hTERTp-EGFP质粒分别转染至肿瘤细胞和正常细胞,观察此两种细胞内绿色荧光蛋白的表达差异。结果成功构建重组质粒hTERTp-EGFP,转染结果显示该质粒在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中无明显表达。结论重组质粒hTERTp-EGFP具有肿瘤特异性表达能力。 展开更多
关键词 端粒酶 端粒酶反转录酶启动子 肿瘤 质粒
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人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定
10
作者 马黎丽 陈昌杰 +1 位作者 杨清玲 章尧 《蚌埠医学院学报》 CAS 2008年第6期665-668,共4页
目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建p... 目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As2O3对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。 展开更多
关键词 白血病 髓母细胞性 基因表达 人端粒酶逆转录酶 启动子 荧光素酶基因表达载体
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人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细胞的生物学特性 被引量：5
11
作者 殷晓雪 陈仲强 +2 位作者 党耕町 郭昭庆 马庆军 《中国临床康复》 CSCD 2003年第26期3550-3551,共2页
目的:研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性,包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法:收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB),绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征,软琼脂... 目的:研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性,包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法:收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB),绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征,软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验检测Clone5是否恶性变。结果:由生长曲线计算出细胞倍增时间:hOB:190h;Clone5:62h;曲线显示Clone5的增殖能力明显增强;流式细胞仪检测发现,Clone5细胞周期中G1期细胞占53.46%,S期细胞占28.24%,凋亡率为0.76%,hOBG1期细胞占79.81%,S期细胞占19.76%,凋亡率为33.33%。和hOB相比,Clone5G1期细胞比例减少,S期比例增加,细胞的凋亡率显著降低;软琼脂集落实验未见细胞团形成,裸鼠接种不致瘤。结论:转导hTERT基因的Clone5增殖能力明显增强,凋亡率降低,且未发生恶性变,可用做组织工程的种子细胞和研究正常骨生理、生化的工具细胞。 展开更多
关键词 人永生化成骨细胞系 Clone5 人端粒酶反转录酶基因 生物学特性 细胞增殖 细胞周期
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携带人端粒酶反转录酶启动子的溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35对乳腺癌干细胞的靶向作用 被引量：2
12
作者 王炜川 陈璐璐 +5 位作者 权香兰 李颖 金永民 金文彪 于可心 张松男 《肿瘤防治研究》 CAS CSCD 2019年第11期971-976,共6页
目的探讨携带人端粒酶反转录酶启动子的溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35在靶向乳腺癌干细胞中的作用。方法乳腺癌细胞系MCF-7以球体形式在加入生长因子的无血清培养基中生长。同时构建携带TERT启动子的溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35,并通过溶瘤、MT... 目的探讨携带人端粒酶反转录酶启动子的溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35在靶向乳腺癌干细胞中的作用。方法乳腺癌细胞系MCF-7以球体形式在加入生长因子的无血清培养基中生长。同时构建携带TERT启动子的溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35,并通过溶瘤、MTT及体内抗肿瘤实验观察RCA-TERT-Ad35对干细胞样癌细胞的杀伤效果。结果与亲代细胞相比,MCF-7球体细胞显示出干细胞特性,且MCF-7球体细胞中hTERT基因过表达,其对细胞毒性剂紫杉醇具有耐药性。溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35在TERT过表达的细胞中进行复制并抑制细胞生长。在裸鼠移植瘤模型中,与RCA-Ad35相比,RCA-TERT-Ad35显著抑制肿瘤生长并改善小鼠的存活状态。结论溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35可优先杀伤TERT过表达的乳腺癌干细胞。 展开更多
关键词 乳腺癌干细胞 人端粒酶反转录酶 溶瘤腺病毒 基因治疗
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人端粒酶反转录酶和脆性组氨酸三联体基因在口腔鳞癌中的表达及意义 被引量：3
13
作者 孟彦 郗彦凤 +2 位作者 韩飞 吴雨雷 高太虎 《中国药物与临床》 CAS 2012年第11期1421-1423,共3页
端粒酶被认为是迄今为止最具有人体肿瘤特异性和敏感性的分子标志物,人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTRT）是端粒酶活性的限速酶,只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达,与端粒酶活性平行相关[1]。... 端粒酶被认为是迄今为止最具有人体肿瘤特异性和敏感性的分子标志物,人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTRT）是端粒酶活性的限速酶,只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达,与端粒酶活性平行相关[1]。脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad,FHIT）是1996年发现的一种抑癌基因, 展开更多
关键词 脆性组氨酸三联体基因 人端粒酶反转录酶 口腔鳞癌 端粒酶活性 分子标志物 肿瘤特异性 永生化细胞 肿瘤细胞
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碱性成纤维细胞生长因子和环磷酸腺苷对神经前体细胞内源性端粒酶反转录酶基因转录水平的调控
14
作者 张小燕 王亚军 +5 位作者 刘胜勇 王建伟 陆爱丽 王珂 张卫光 沈丽 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期479-483,共5页
目的探讨人类神经前体细胞中内源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的转录活性及增殖与分化相关调控机制。方法采用系列hTERT基因启动子的荧光素酶报告载体和β-半乳苷酶表达载体,瞬时共转染HeLa细胞和hNPCs-G3细胞,检测不同长度启动子的... 目的探讨人类神经前体细胞中内源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的转录活性及增殖与分化相关调控机制。方法采用系列hTERT基因启动子的荧光素酶报告载体和β-半乳苷酶表达载体,瞬时共转染HeLa细胞和hNPCs-G3细胞,检测不同长度启动子的活性。分析碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进增殖过程中hTERT基因启动子活性,分析cAMP诱导分化过程中hTERT基因启动子活性。结果 hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,主要依赖近端启动子区。bFGF上调hNPCs-G3神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,其调控主要作用在-2 098～-1 099bp区域和-3 216bp～-2 098bp区域内;cAMP抑制hNPCs-G3神经前体细胞hTERT基因的转录,其调控主要作用在近端启动子区。结论神经前体细胞内源性hTERT基因的转录活性较低,bFGF可上调神经前体细胞内源性hTERT基因的表达,cAMP则可抑制hTERT基因的转录。 展开更多
关键词 神经前体细胞 人端粒酶反转录酶 启动子 转录 荧光素酶检测
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人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析
15
作者 黄燕燕 续力云 刘晓光 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期208-215,共8页
目的构建由人端粒酶反转录酶(h TERT)启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。方法将h TERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成... 目的构建由人端粒酶反转录酶(h TERT)启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。方法将h TERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-h TERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的c DNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析。结果经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升(P<0.05);与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调。结论 h TERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果。 展开更多
关键词 人端粒酶反转录酶 启动子 microRNA-21海绵抑制剂 慢病毒载体的构建 实时定量聚合酶链反应 基因芯片
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人端粒酶反转录酶基因电转染优化培养大鼠前软骨干细胞
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作者 彭义 曲家富 +2 位作者 曹立海 赵国志 杜晓健 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2016年第14期2110-2116,共7页
背景:将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中,可以提高其端粒酶活性,保持端粒的长度,在调控增殖和分化方面有重要作用。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。方法:体外培养Wistar... 背景:将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中,可以提高其端粒酶活性,保持端粒的长度,在调控增殖和分化方面有重要作用。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。方法:体外培养Wistar大鼠前软骨干细胞,以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染,同时设置对照组、阴性对照序列组、转染组。用TRAP-ELISA法检测前软骨干细胞端粒酶活性,RT-PCR、Western blot检测前软骨干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:(1)人端粒酶反转录酶基因转染前软骨干细胞48 h,端粒酶活性明显升高;(2)与对照组、阴性对照序列组相比,转染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平表达明显,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞数减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P<0.05);(3)结果表明,以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使前软骨干细胞端粒酶活性明显升高,能够促进大鼠前软骨干细胞增殖。 展开更多
关键词 端粒 末端转移酶 转染 软骨细胞 组织工程 干细胞 培养 端粒酶反转录酶 基因 电转染 大鼠 前软骨干细胞
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反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响
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作者 黄吉燕 刘伟 +1 位作者 周曾同 周海文 《上海口腔医学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期304-307,共4页
目的：以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因（hTRT）转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法：将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性... 目的：以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因（hTRT）转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法：将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果：获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论：转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。 展开更多
关键词 体外培养 人口腔黏膜角化细胞 端粒酶反转录酶 反转录病毒 基因转染
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人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达
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作者 高焱章 卢永昕 +3 位作者 米少华 荣书玲 刘晓明 梁振涛 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第51期10037-10040,共4页
目的：检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后，心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化，以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达。方法：人胰岛素样生长因子Ⅰ... 目的：检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后，心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化，以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达。方法：人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备。健康雄性SD大鼠90只，取12只作为假手术组，剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，结扎后24h存活36只，随机分为对照组和实验组，18只，组。造模后24h，实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0．1mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液，（2-4）×10^10L^-1细胞；对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液。应用ELⅠSA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达，RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ与端粒酶反转录酶mRNA水平。结果：①细胞移植后1，2，4周，假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化（P〉0．05）；与假手术组比较，实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低（P〈0．01），心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高，于第2周达峰值（P〈0．01），且实验组较对照组升高更为显著（P〈0．01）。②细胞移植后1，2，4周，假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达；实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ，含量显著高于其余两组（P〈0．01）。③细胞移植后第1周，实验组和对照组心肌细胞鼠胰岛素样生长因子ⅠmRNA相对表达量明显高于假手术组（P〈0．01）：至第2周实验组达峰值，显著高于对照组（P〈0．01），然后逐步下降。实验组和对照组心肌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达均逐渐呈升高趋势，且实验组更为显著（P〈0．01）。结论：人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后，能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ，明显促进心肌梗死早期大鼠心肌细胞鼠胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达，同时可持续促进心肌及全身其他组织鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌。 展开更多
关键词 成肌细胞 基因修饰 类胰岛素生长因子 端粒酶反转录酶 心肌梗死
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人端粒酶反转录功能区基因的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化
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作者 苗佩宏 刘北一 +2 位作者 郑山根 庞建新 徐江平 《武警医学》 CAS 2006年第2期88-92,共5页
目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础。方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能... 目的表达并纯化出包含所有功能基序的端粒酶催化亚基(hTERT)融合蛋白,为深入研究端粒酶作用机制、制备抗hTERT抗体和肽库筛选以端粒酶为靶的小分子抑制剂奠定基础。方法自行设计引物,以pLPC-hTERT为模板扩增出包括端粒酶发挥反转录功能所需的全部8个基序长为1 310 bp的基因片段,将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET-32a中,IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE和Western-Blot(WB)检测确定表达出端粒酶反转录酶功能区融合蛋白,以8 M尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白,用金属鳌合层析柱纯化融合蛋白并对之进行复性。结果经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE和WB鉴定证实成功构建了表达质粒pET32a-hTERT,鉴定和测序结果亦证实包含全部8个基序的基因片段,凝胶电泳和WB确认表达出特异性的目的蛋白条带。结论成功构建pET32a-hTERT表达质粒,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得特异性的hTERT重组蛋白。 展开更多
关键词 端粒酶 端粒酶反转录酶 基因表达 蛋白纯化
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携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响
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作者 梁亮 徐韬 +1 位作者 宋扬 盛伟斌 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2015年第11期1707-1711,共5页
背景:端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的:利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞... 背景:端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的:利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞,并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法:原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组,转染后并测其转染率,且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论:端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示,端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明,携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。 展开更多
关键词 基因 细胞 组织构建 组织工程 端粒酶 端粒酶反转录酶 慢病毒载体 RNA干扰 星形胶质细胞 转染 凋亡 脊髓损伤 胶质瘢痕 新疆维吾尔自治区自然科学基金
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