多肽片段连接方法及肽硫酯和肽醛的合成 被引量：5

1

作者 麻远 赵玉芬 《化学进展》 SCIE CAS CSCD 2003年第5期393-400,共8页

本文综述了多肽和蛋白质合成中的片段连接方法 ,这是近年来多肽和蛋白质合成领域中方法学上的重要进展。该方法使用非保护的多肽片段 ,无需酶或化学活化试剂 ,在缓冲溶液中能够高产率地获得多肽和蛋白质。还介绍了与多肽片段连接有关的... 本文综述了多肽和蛋白质合成中的片段连接方法 ,这是近年来多肽和蛋白质合成领域中方法学上的重要进展。该方法使用非保护的多肽片段 ,无需酶或化学活化试剂 ,在缓冲溶液中能够高产率地获得多肽和蛋白质。还介绍了与多肽片段连接有关的肽硫酯和肽醛的合成方法。 展开更多

关键词 多肽 蛋白质 片段连接 肽硫酯 肽醛 亚胺 硫醚

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一步法快速构建多片段连接的同源臂载体 被引量：5

2

作者 张金脉 杨冠恒 +1 位作者 程艳 黄英 《生物技术通讯》 CAS 2013年第3期385-389,共5页

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左... 目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段，纯化后一起加入一个反应管中，并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液，进行酶切、酶连接共10～50个循环反应，一步构建含同源臂载体的质粒；产物经高温处理后，直接转化感受态细胞，并进行重组子PCR鉴定；对pMD19－T载体进行优化，突变载体上的BsaⅠ酶切位点，把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体，再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明，应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体；用优化后的pMD19－T－O载体体系，在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠，不仅可快速构建某类载体系统，还可对基因进行精确的点突变，该系统可用于快速构建基因打靶载体。 展开更多

关键词 同源臂 多片段酶连接 载体构建 一步连接法

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部分扩增结合双片段连接法克隆系列截短基因突变体 被引量：3

3

作者 梁明星 马梦琪 +2 位作者 程盈盈 王媛 陈华波 《生物技术进展》 2021年第1期111-117,共7页

体外合成DNA伴随的随机突变是制约基因定点突变效率的重要因素。以克隆周期蛋白E(cyclin E)及其截短基因的激酶活性缺失突变体为例,对传统重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)作适当改进,提出一种系列相关基因定点突变的优化方... 体外合成DNA伴随的随机突变是制约基因定点突变效率的重要因素。以克隆周期蛋白E(cyclin E)及其截短基因的激酶活性缺失突变体为例,对传统重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)作适当改进,提出一种系列相关基因定点突变的优化方案。前期研究中已克隆了cyclin E基因及其2个截短基因T1、T2,并通过Eco RⅠ/SalⅠ双酶切插入pEGFP_C2载体。限制性酶切分析发现cyclin E基因序列中含有1个AgeⅠ位点将其分为F1、F2两段,目标突变位点KD位于F2段。对于cyclin E及其截短基因,F2段是完全一致的。因此,通过重叠延伸PCR扩增含突变位点的共有片段F2,从C2-cyclin E、C2-cyclin E_T1和C2-cyclin E_T2这3个原始质粒中切取相应的F1片段,再将F1与酶切的F2一起连接插入载体以重构完整突变体。对比检测发现OE-PCR扩增较短DNA片段更易成功。C2-cyclin E、C2-cyclin E_T1和C2-cyclin E_T2这3组均能筛选出一定数量克隆,经检测和序列鉴定,每组各得到1个序列完全准确的目标突变体。研究表明,采用部分扩增可以缩短DNA合成长度,避免了目标基因反复扩增等不利因素,从而减少随机突变;双片段连接避免了双AgeⅠ位点对常规酶切-连接的限制。两者相结合,可作为其他系列相关基因定点突变的优化方案。 展开更多

关键词 基因定点突变 截短基因 双片段连接 周期蛋白E

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分裂内含肽:一种高效的无痕多肽片段连接工具 被引量：1

4

作者 韩东阳 任宇祥 +2 位作者 杨子毅 黄赫 郑基深 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第10期44-61,共18页

分裂内含肽通过剪接反应实现多肽片段的连接,具有高效且无痕的特点,受到了广泛关注.本文基于分裂内含肽的结构特征与剪接反应过程,结合近年来关于分裂内含肽性能优化和应用研究进展进行了综合评述,揭示其作为一种日渐成熟的蛋白质工程... 分裂内含肽通过剪接反应实现多肽片段的连接,具有高效且无痕的特点,受到了广泛关注.本文基于分裂内含肽的结构特征与剪接反应过程,结合近年来关于分裂内含肽性能优化和应用研究进展进行了综合评述,揭示其作为一种日渐成熟的蛋白质工程化技术在蛋白质化学合成领域的前景,并简要分析了目前分裂内含肽工具面临的问题与挑战,并对可能的解决方案进行了展望. 展开更多

关键词 分裂内含肽 蛋白质剪接反应 定点修饰 蛋白质化学合成 多肽片段连接

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双片段连接法克隆融合基因及其突变体 被引量：1

5

作者 王媛 程盈盈 +2 位作者 马梦琪 梁明星 陈华波 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期39-42,共4页

为降低体外扩增DNA而引入随机突变的风险,仅通过PCR在CDK2序列5′端接入连接序列。由于双Bam HⅠ位点的干扰,cyclin E与CDK2序列无法依次插入载体,故采用双片段连接法将两者一起连接插入质粒载体以构建融合基因;采用相似策略,用CDK2突... 为降低体外扩增DNA而引入随机突变的风险,仅通过PCR在CDK2序列5′端接入连接序列。由于双Bam HⅠ位点的干扰,cyclin E与CDK2序列无法依次插入载体,故采用双片段连接法将两者一起连接插入质粒载体以构建融合基因;采用相似策略,用CDK2突变体序列替换融合基因中对应野生型序列以构建融合基因突变体。两组双片段连接物转化感受态大肠杆菌后均能筛选出若干菌落,并成功鉴定出目标克隆。双片段连接法突破了严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,拓宽了酶切-连接法拼接DNA片段的适用范围。据此可充分利用现有条件,通过灵活置换DNA片段简化融合基因及其突变体克隆流程。 展开更多

关键词 基因克隆 融合基因 双片段连接法 周期蛋白E 周期蛋白依赖性激酶2

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初步探讨多肽片段连接、衍生物及偶合物的化学合成

6

作者 戚斌 徐波 狄绍炎 《中国化工贸易》 2013年第1期114-114,共1页

随着我国医疗事业的不断发展，多肽及其衍生物在医药方面得到了广泛的应用。为了适应医疗发展对多肽及其衍生物的大量需求，目前，绝大部分多肽及其衍生物均是采用化学的方式合成的。本文将从化学合成的角度，介绍组合化学法、液相分段... 随着我国医疗事业的不断发展，多肽及其衍生物在医药方面得到了广泛的应用。为了适应医疗发展对多肽及其衍生物的大量需求，目前，绝大部分多肽及其衍生物均是采用化学的方式合成的。本文将从化学合成的角度，介绍组合化学法、液相分段合成法以及氨基酸羧内酸酐法等方法来对多肽及其衍生物的化学合成进行综述，并对多肽及其衍生物在医学方面的应用进行概述，对其发展前景进行展望。 展开更多

关键词 多肽 片段连接 衍生物 化学合成

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一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法 被引量：6

7

作者 钟志成 黎诚耀 +6 位作者 朱利 张玲 万成松 马丹娟 杨瑜 熊建英 赵卫 《热带医学杂志》 CAS 2010年第3期253-257,共5页

目的通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法。方法扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3kb的短片段,以之作为亚片段模板。在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的长片段扩增... 目的通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法。方法扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3kb的短片段,以之作为亚片段模板。在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到最佳重叠延伸浓度。结果获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法。采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2kb的长片段,且实验重复性、特异性好。结论本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度。多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作。 展开更多

关键词 重叠延伸PCR(SOE-PCR) 突变 多片段连接 EIAV PLG3-8

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多肽片段连接:合成蛋白质的一种新方法 被引量：10

8

作者 麻远 赵玉芬 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2002年第16期1201-1205,共5页

蛋白质结构与活性关系的研究始终是生命科学领域的研究热点. 特别是人类基因组测定工作完成以后, 在人类后基因组即蛋白质组学研究中, 将需要合成大量的多肽和蛋白质.

关键词 多肽片段连接 蛋白质 合成方法 化学结构 生物活性 硒代半胱氨酸 蛋氨酸

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半胱氨酸肽片段连接法合成ω-芋螺毒素MVIIA

9

作者 代先东 范崇旭 +3 位作者 曹瑛 刘尚义 蒋辉 陈冀胜 《化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2010年第7期667-671,共5页

ω-芋螺毒素MVIIA是已上市的镇痛药Ziconotide的有效成分.采用标准Fmoc保护策略在聚苯乙烯树脂上合成ω-MVIIA比较困难,是固相合成中的"困难肽".本研究将ω-MVIIA分为N-端15肽硫酯和C-端10肽两个片段采用标准Fmoc保护策略分... ω-芋螺毒素MVIIA是已上市的镇痛药Ziconotide的有效成分.采用标准Fmoc保护策略在聚苯乙烯树脂上合成ω-MVIIA比较困难,是固相合成中的"困难肽".本研究将ω-MVIIA分为N-端15肽硫酯和C-端10肽两个片段采用标准Fmoc保护策略分别合成,再通过半胱氨酸肽片段连接得到全长的ω-芋螺毒素MVIIA肽链.该方法提高了合成ω-芋螺毒素MVIIA产率.该研究为"困难肽"的合成提供了较好的参考方法. 展开更多

关键词 半胱氨酸肽片段连接 多肽硫酯 多肽合成 ω-芋螺毒素MVIIA

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Dystrophin基因51号外显子缺失连接片段的克隆和测序 被引量：2

10

作者 潘速跃 张成 +2 位作者 刘焯霖 陈国俊 卢锡林 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第2期105-110,共6页

为了解Dystrophin基因缺失断裂点和连接片段的序列特点 ,以分析Dystrophin基因缺失的分子机制 ,利用巢式反向PCR克隆了 1名 5 1号外显子缺失DMD(DuchenneMuscularDystrophy ,DMD)患者的缺失连接片段 ,通过测序 ,确定 5′和 3′断裂点及... 为了解Dystrophin基因缺失断裂点和连接片段的序列特点 ,以分析Dystrophin基因缺失的分子机制 ,利用巢式反向PCR克隆了 1名 5 1号外显子缺失DMD(DuchenneMuscularDystrophy ,DMD)患者的缺失连接片段 ,通过测序 ,确定 5′和 3′断裂点及连接片段的序列。对 5′、3′断裂点和连接片段进行重复序列、TOPOI、TOPOII酶切位点等分析。结果共测得 5 0号内含子 16 14bp ,确定该患者Dystrophin基因的 5′断裂点位于THE1(Transposon likeHumanElement,THE)内 ,3′断裂点位于L2序列内。连接片段有 3bp的连接同源序列cta ,局部无小的缺失、插入和碱基置换。本研究首次在 5 0号内含子内发现一THE1序列 ,再次发现Dystrophin基因的缺失断裂点位于THE1结构内。反向PCR操作简单、耗时短 ,可以推扩应用于缺失连接片段的克隆 ;THE1可能与部分Dystrophin基因的缺失有关 ;Dystrophin基因缺失大多与同源重组无关 ,非同源末端连接可能参与了Dystrophin基因缺失的形成。 展开更多

关键词 肌营养不良症 缺失机制 连接片段 外显子 DYSTROPHIN基因 克隆 测序

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Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序 被引量：1

11

作者 钟敏 潘速跃 +2 位作者 陆兵勋 姜立 李伟 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期757-759,共3页

目的通过对抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因3-5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3-5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法... 目的通过对抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因3-5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3-5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果获得2113bpPCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5'端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3'端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复(GGCTTATATTTAA)连接断裂点两端。结论推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。 展开更多

关键词 肌营养不良症 连接片段 基因缺失

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缺失型Duchenne型肌营养不良症基因连接片段的BAC克隆和断裂点的分子结构特征 被引量：1

12

作者 盛文利 陈江瑛 +1 位作者 曾进胜 黄如训 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期374-376,共3页

目的　分析缺失型Duchenne型肌营养不良症 (DMD)缺失热区第 46号外显子缺失后形成的连接片段的断裂点的分子结构特点 ,并分析分子结构特点与内含子高不稳定性及外显子缺失的关系。方法　多重引物PCR法鉴定第 46号外显子缺失的DMD患者 ,... 目的　分析缺失型Duchenne型肌营养不良症 (DMD)缺失热区第 46号外显子缺失后形成的连接片段的断裂点的分子结构特点 ,并分析分子结构特点与内含子高不稳定性及外显子缺失的关系。方法　多重引物PCR法鉴定第 46号外显子缺失的DMD患者 ,用BAC载体克隆第 46号外显子缺失后形成的连接片段 ,测定断裂点侧翼的核苷酸序列。结果　第 46号外显子缺失后 ,5’端断裂点位于 45号内含子的AT富含区内。 3’端断裂点位于 46号内含子MER1类重复序列内。连接片段有两个bp的连接同源序列ta ,局部无小的缺失、插入和碱基的置换。第 46号外显子缺失后连接片段的断裂点的二级结构分析示断裂点均位于单链发夹环的非匹配区。结论　第 46号外显子缺失后形成的连接片段 ,其断裂点的共同特征是均位于重复序列 ,这些重复序列形成的单链发夹结构 ,使DNA结构具有不稳定性 ,易于断裂并导致外显子缺失。 展开更多

关键词 缺失型Duchenne型肌营养不良症 基因连接片段 抗肌萎缩蛋白基因 分子结构 基因缺失 BAC克隆 断裂点

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连接片段在Duchenne型肌营养不良症携带者检测中的应用

13

作者 钟敏 潘速跃 李伟 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1308-1311,共4页

目的探讨连接片段在缺失型Duchenne型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）携带者检测中的应用价值。方法对1个DMD家系和1例DMD散发病例进行研究。DMD家系中以确诊的患者Ⅲ2和待查携带者Ⅱ3为研究对象;散发病例以患者Ⅱ1及... 目的探讨连接片段在缺失型Duchenne型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）携带者检测中的应用价值。方法对1个DMD家系和1例DMD散发病例进行研究。DMD家系中以确诊的患者Ⅲ2和待查携带者Ⅱ3为研究对象;散发病例以患者Ⅱ1及其母亲Ⅰ2为研究对象。通过外显子检测确定家系中患者Ⅲ2第31~43外显子缺失,散发病例患者Ⅱ1第45~54外显子缺失。然后以PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点,最后在尽量靠近断裂连接点处设计1对引物直接对患者及其待查女性亲属进行连接片段的PCR扩增。结果对上述DMD家系中待查女性Ⅱ3的检测结果为PCR扩增出与患者Ⅲ2一致的阳性片段,诊断其为DMD携带者。对散发病例患者母亲Ⅰ2的检测结果为PCR反应阴性,而对照的患者Ⅱ1扩增出阳性结果,排除其母亲为DMD携带者。结论利用常规PCR技术直接检测缺失型DMD患者的女性亲属是否带有连接片段,可以同样达到进行携带者检测的目的。该方法有别于目前DMD携带者检测中所使用的各种定量分析方法。 展开更多

关键词 DUCHENNE型肌营养不良症 基因缺失 连接片段 携带者检测

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纤维连接蛋白EDA片段拷贝数变异在乳腺癌诊断及预后评价中的意义

14

作者 张继运 管苗苗 +3 位作者 蒋威华 许文婷 雪莱提·派祖拉 李涌涛 《中国现代普通外科进展》 CAS 2020年第6期448-450,共3页

目的:探讨纤维连接蛋白EDA片段拷贝数变化在乳腺癌诊断及预后评价中的意义。方法 :选取100例乳腺癌手术患者的癌灶及癌旁组织标本,采用AccuCopy TM多重基因拷贝数检测技术进行纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测。结果:76%癌灶呈EDA片段多... 目的:探讨纤维连接蛋白EDA片段拷贝数变化在乳腺癌诊断及预后评价中的意义。方法 :选取100例乳腺癌手术患者的癌灶及癌旁组织标本,采用AccuCopy TM多重基因拷贝数检测技术进行纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测。结果:76%癌灶呈EDA片段多拷贝状态,只有2%癌旁组织呈多拷贝状态。依据淋巴结转移情况将患者分为无转移、1~3枚转移、≥4枚转移3组,癌组织标本EDA片段多拷贝比例分别为21.4%、68.8%、94.4%,差异有统计学意义(P<0.05);依据Ki67表达情况将患者分为≤20%、20%~50%、>50%3组,癌组织标本EDA片段多拷贝比例分别为20.0%、79.2%、94.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测可以辅助诊断乳腺癌,对患者预后有一定指导意义。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤 纤维连接蛋白EDA片段 拷贝数变异

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耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用 被引量：2

15

作者 周翔达 宋晓 +3 位作者 怀聪 孙海燕 陈红岩 卢大儒 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期163-169,共7页

传统的DNA重组方法 TypeⅡ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction,TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用... 传统的DNA重组方法 TypeⅡ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction,TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板——Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。 展开更多

关键词 DNA片段连接 耐热型连接酶 HELPER DNA片段捕获 复杂混合体系

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基于片段的先导化合物发现中的核磁应用 被引量：1

16

作者 阮科 高佳 马荣声 《波谱学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期163-181,共19页

基于片段的药物筛选与设计在过去10年开始出现并获得了重要的应用,数十种基于片段的药物已经进入临床测试期.源于靶标蛋白和小分子片段本质上的弱相互作用,现代核磁技术在其中发挥着无可替代的作用.该文简略介绍了核磁片段筛选的基本流... 基于片段的药物筛选与设计在过去10年开始出现并获得了重要的应用,数十种基于片段的药物已经进入临床测试期.源于靶标蛋白和小分子片段本质上的弱相互作用,现代核磁技术在其中发挥着无可替代的作用.该文简略介绍了核磁片段筛选的基本流程和重要概念,包括靶标蛋白的选择、片段库的设计、质量控制和重要的核磁筛选技术.在后续的基于片段的先导化合物发现阶段,阐述了核磁新技术的基本理论框架,包括化学位移扰动、分子间NOE、残留偶极耦合和顺磁标记等方法,以及这些新技术在靶标/配基复合体结构研究中的实际应用,穿插演示了片段组装的基本思路和成功案例. 展开更多

关键词 核磁共振(NMR) 基于片段的先导化合物发现 片段增长 片段连接 STD Water— LOGSY

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多西环素在纤维连接蛋白诱导髓核细胞退变过程中的作用 被引量：1

17

作者 张海飞 赵广 张治宇 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2018年第20期3123-3129,共7页

背景:多西环素在阻止间盘退变方面有一定的作用,但是其在椎间盘中抑制基质金属蛋白酶的机制并未完全阐明。目的:从分子内信号传导角度采用细胞实验来阐明多西环素抑制间盘内基质金属蛋白酶的作用机制。方法:体外培养人间盘髓核细胞,在... 背景:多西环素在阻止间盘退变方面有一定的作用,但是其在椎间盘中抑制基质金属蛋白酶的机制并未完全阐明。目的:从分子内信号传导角度采用细胞实验来阐明多西环素抑制间盘内基质金属蛋白酶的作用机制。方法:体外培养人间盘髓核细胞,在培养液中加入相对分子质量为45 000纤维连接蛋白片段制造退变模型。在退变模型中按照不同作用时间及不同作用浓度分组,均通过Western blot方法检测各组Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13蛋白的表达情况。然后在10 mg/L多西环素作用24 h后,Western blot方法测定各组ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白表达水平,并根据以上实验结果选择ERK及JNK通路抑制后,Western blot检测多西环素对MAPK通路蛋白表达的影响。结果与结论:(1)纤维连接蛋白可以诱导髓核细胞退变,表现为基质金属蛋白酶13表达增加、Ⅱ型胶原表达降低。多西环素可以抑制纤维连接蛋白诱导的退变髓核细胞基质金属蛋白酶13的表达,但并不呈时间依赖性和剂量依赖性;(2)多西环素作用于经纤维连接蛋白诱导的髓核细胞后可以抑制其ERK1/2及JNK磷酸化,双重抑制有效地阻断了ERK1/2及JNK在髓核细胞中的激活,与多西环素或MAPK抑制剂单独作用相比,这种联合作用协同地增强了对ERK及JNK磷酸化的抑制作用。因此多西环素可能通过阻断ERK1/2及JNK在髓核细胞中的激活来抑制金属基质蛋白酶表达,进而减少细胞外基质降解,具有预防和治疗间盘退变的潜在作用。 展开更多

关键词 纤连蛋白类 多西环素 组织工程 髓核细胞 间盘退变 纤维连接蛋白片段 细胞外信号调节激酶 基质金属蛋白酶 Ⅱ型胶原 细胞外基质

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多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因

18

作者 陈婉煜 刘君怡 +2 位作者 李国庆 刘媛媛 陈华波 《生物医学》 CAS 2022年第1期1-8,共8页

鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用... 鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。从双片段连接物中筛选出上百个菌落,经检测和序列测定,得到一个序列完全准确的克隆。对于难以直接克隆的长基因,可先扩增其各个片段,再将它们拼接成完整基因。其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,再辅以重叠延伸PCR融合法,即可实现多个基因片段的正确拼接。 展开更多

关键词 基因克隆 重叠延伸PCR 双片段连接法 人表皮生长因子受体2基因

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MICB基因的克隆及其在原核系统中的表达 被引量：1

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作者 应燕玲 陶苏丹 +4 位作者 陈男英 和艳敏 何吉 朱发明 吕杭军 《中国输血杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第S1期120-121,共2页

目的将中国汉族人群中不同分布频率的MICB基因克隆到原核表达系统,表达MICB蛋白并对蛋白进行鉴定和纯化,为体外建立MICB抗体检测方法和研究MICB等位基因功能奠定基础。方法收集外周血标本测序分析MICB基因2～4号外显子,获取不同分布频... 目的将中国汉族人群中不同分布频率的MICB基因克隆到原核表达系统,表达MICB蛋白并对蛋白进行鉴定和纯化,为体外建立MICB抗体检测方法和研究MICB等位基因功能奠定基础。方法收集外周血标本测序分析MICB基因2～4号外显子,获取不同分布频率的基因型,分别将分布频率】50%的MICB*005等位基因,分布频率为10%左右的MICB*00201、MICB*00401的等位基因,和分布频率【1%的MICB*018等位基因的外周血标本提取总RNA,经RT-PCR获取此4个等位基因的cDNA。扩增此4个MICBcDNA2～4号外显子,将目的片段连接至TOPO克隆载体,提取质粒测序分析, 展开更多

关键词 原核系统 基因克隆 MICB 分布频率 外周血标本 抗体检测 片段连接 TOPO 克隆载体 RNA

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PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

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作者 魏汉东 瞿成奎 +1 位作者 贺福初 吴祖泽 《生物技术通讯》 CAS 1994年第2期95-96,共2页

阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后,为了鉴定转化子中插入片段的存在,目前常采用的方法有:①通过特异探针从菌落原位杂交筛选。②通过快提质... 阳性重组子的筛选与鉴定是分子克隆实验中经常遇到的一个重要问题。DNA片段连接产物转化感受态大肠杆菌后经相应抗生素抗性粗筛后,为了鉴定转化子中插入片段的存在,目前常采用的方法有:①通过特异探针从菌落原位杂交筛选。②通过快提质粒DNA后,依据分子量大小及酶切图谱进行鉴定。但这两种方法均存在各自的不足。如:周期较长,需进行同位素操作。 展开更多

关键词 阳性重组子 PCR技术 分子量大小 片段连接 菌落原位杂交 转化子 分子克隆 插入片段 转化感受态 重组质粒

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