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烟酰胺核糖激酶在大肠杆菌中的高效异源表达、酶学特性分析和发酵工艺探究
1
作者 毛歆安 龚劲松 +4 位作者 苏畅 李恒 徐国强 许正宏 史劲松 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第6期50-57,共8页
烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN),是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选,实现Nrk在大肠杆菌中的可溶表... 烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN),是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选,实现Nrk在大肠杆菌中的可溶表达,初始酶活力为2.14 U/mL。通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列和启动子优化,将翻译起始速率为35000 a.u.的RBS序列与双启动子P alsR-T7组合,构建的重组菌酶活力可达5.56 U/mL,是初始水平的2.6倍。Nrk酶学性质研究表明,该酶的最适反应条件为50℃,pH 7.0,10 mmol/L Mg^(2+)。最后,对产Nrk重组菌进行培养条件优化,并在5 L发酵罐中进行罐上产酶放大工艺研究,最终使得酶活力达到72.33 U/mL,是摇瓶发酵水平的13倍。该研究显著提升了Nrk在大肠杆菌中的异源表达水平,为β-NMN的生物酶法合成奠定了基础。 展开更多
关键词 烟酰胺核糖激酶 β-烟酰胺单核苷酸 核糖体结合位点 启动子工程 异源表达
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基于理性设计提高酿酒酵母烟酰胺核糖激酶1热稳定性
2
作者 王瑶 沈太松 +3 位作者 李思晨 史红玲 姚伦广 唐存多 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第24期92-99,共8页
为了提高来源于酿酒酵母的烟酰胺核糖激酶1(nicotinamide riboside kinase 1 from Saccharomyces cerevisiae,Sc NRK1)的热稳定性,本研究基于计算机辅助技术虚拟筛选出Sc NRK1的6个单点突变体,通过定点突变技术完成6个单点突变的表达及... 为了提高来源于酿酒酵母的烟酰胺核糖激酶1(nicotinamide riboside kinase 1 from Saccharomyces cerevisiae,Sc NRK1)的热稳定性,本研究基于计算机辅助技术虚拟筛选出Sc NRK1的6个单点突变体,通过定点突变技术完成6个单点突变的表达及酶学特性分析,然后挑选出3个优势突变体进行第2轮的组合突变。结果显示,经过两轮突变,获得了1个热稳定性和催化活性均显著提高的突变体T136P/S209A,其最适反应温度提高至45℃,45℃条件下的半衰期为48.98 min,是野生型Sc NRK1的4.2倍;其比活力为146.63 IU/mg,是野生型的1.98倍。本研究基于理性设计的手段,成功获得了热稳定性和催化活性显著增强的Sc NRK1突变体,有望为通过理性设计提高酶分子的热稳定性提供新思路,为烟酰胺单核苷酸的高效、低成本生产提供新酶源。 展开更多
关键词 烟酰胺核糖激酶1 理性设计 定点突变 热稳定性 烟酰胺单核苷酸
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基于理性设计的烟酰胺核糖激酶活性提升及应用 被引量：1
3
作者 李巧峰 童卫民 王润玲 《云南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2023年第2期175-182,共8页
烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是NAD+的前体,补充NMN可有效恢复体内NAD+水平,并改善与NAD+下降相关的病理状态和疾病.目前NMN主要通过酶法生产,但是酶的催化活性较低,使得酶法合成NMN的成本仍然较高.来源于人的烟酰... 烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是NAD+的前体,补充NMN可有效恢复体内NAD+水平,并改善与NAD+下降相关的病理状态和疾病.目前NMN主要通过酶法生产,但是酶的催化活性较低,使得酶法合成NMN的成本仍然较高.来源于人的烟酰胺核糖激酶NRK1可以催化ATP和烟酰胺核糖合成NMN,因此,以提升烟酰胺核糖激酶NRK1的催化活性为目的,利用理性设计的策略和定点突变技术,通过氨基酸序列比对和结构分析,设计了NRK1的2个突变体NRK1(T47V)和NRK1(N62D),并在大肠杆菌中成功表达.实验表征发现,二者的催化特性均得到了提升,且NRK1(T47V)具有更好的催化特性,其活性较NRK1提高130%,催化效率k_(cat)/K_(m)和稳定性分别较NRK1提高了100%和20%.在较大反应体系中反应100 min时,NRK1(T47V)催化底物烟酰胺核糖的转化率为78%,较NRK1提高15.4%,产物NMN的产量为4.13 g/L,较NRK1提高38%.该结果表明,活性中心附近氨基酸的理性突变能显著提高NRK1酶的催化活性. 展开更多
关键词 烟酰胺核糖激酶 理性设计 定点突变 活性 烟酰胺单核苷酸(NMN)
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重组大肠杆菌全细胞催化合成β-烟酰胺单核苷酸 被引量：1
4
作者 傅传杰 全浩龙 +1 位作者 杨敏 黄建忠 《福建农业科技》 CAS 2022年第12期9-15,共7页
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种天然存在的维生素B族活性衍生物,具有改善哺乳动物生育能力和肠道功能的作用。以大肠杆菌BW25113为表达宿主,根据NCBI数据库中烟酰胺核糖激酶(NRK)的蛋白序列,同源比对分析合成不同来源的Nrk基因,筛选获得... β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种天然存在的维生素B族活性衍生物,具有改善哺乳动物生育能力和肠道功能的作用。以大肠杆菌BW25113为表达宿主,根据NCBI数据库中烟酰胺核糖激酶(NRK)的蛋白序列,同源比对分析合成不同来源的Nrk基因,筛选获得1株高效转化烟酰胺核糖(NR)合成NMN的重组菌株NRK-Gs/BW,在含有50 mmol·L^(-1)NR和10 mmol·L^(-1)ATP体系中能够合成43 mmol·L^(-1)的NMN。进一步引入多聚磷酸激酶(PPK2)构建ATP循环系统,ATP用量降低了80%,反应体系中AMP生成量≤3 mmol·L^(-1)。最后,通过析因设计对反应体系进行优化,在50 mmol·L^(-1)NR和10 mmol·L^(-1)ATP的反应体系中,NMN产量为49.96 mmol·L^(-1),摩尔转化率达到99.96%。通过构建了含有ATP循环系统的NR合成NMN工程菌,大幅度降低了ATP的使用摩尔比,为后续的NMN生产化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 β-烟酰胺单核苷酸 烟酰胺核糖 大肠杆菌 烟酰胺核糖激酶 多聚磷酸激酶
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β-烟酰胺单核苷酸功能与合成研究进展 被引量：16
5
作者 任丽梅 王晓茹 +5 位作者 祁永浩 韩广欣 韩天淼 桂阳 张淼 李小兵 《生物资源》 CAS 2021年第2期127-132,共6页
β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是辅酶I——NAD^(+)(nicotinamide adenine dinucleotide)合成的关键中间体,存在于各种生物体内。NAD^(+)广泛参与体内多种反应,对人体健康起着非常重要的作用。服用烟酰胺单核苷酸... β-烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是辅酶I——NAD^(+)(nicotinamide adenine dinucleotide)合成的关键中间体,存在于各种生物体内。NAD^(+)广泛参与体内多种反应,对人体健康起着非常重要的作用。服用烟酰胺单核苷酸后可以快速提升体内NAD^(+)水平,从而在体内起到多种关键功能。近年来,研究NMN为年龄相关性功能衰退和疾病的发病机制提供了许多重要的见解。研究发现NMN具有多种功能作用,例如抗衰老,促进心脑健康等。NMN已经成为保健品、食品原料等领域研究的热点,其市场容量增长迅速,目前已有多种以NMN为主要成分的保健品上市销售。基于NMN持续火热的研究态势以及未来巨大的市场预期,本文较为系统地综述了NMN的研究背景、作用机理、保健功能、全球品牌产品、主要的化学方法与生物学方法的合成路线等,旨在为普及以及推动NMN在人类健康领域的研究和应用提供参考。 展开更多
关键词 β-烟酰胺单核苷酸 烟酰胺磷酸核糖转移酶 烟酰胺核糖激酶 酶法合成 抗衰老
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