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毕赤酵母分泌表达系统的研究进展 被引量：1
1
作者 黄石 邹民吉 徐东刚 《医学研究通讯》 2004年第7期34-36,共3页
毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。
关键词 毕赤酵母分泌表达系统 研究进展 巴斯德毕赤酵母 高效分泌表达 AOXl启动子 生物学特性
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巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展 被引量：16
2
作者 路蓉 安云庆 《临床和实验医学杂志》 2004年第1期43-47,共5页
巴斯德毕赤酵母表达系统可使用强效的醇氧化酶 1(AOX1)启动子 ,在甲醇诱导下实现外源基因的高效表达。外源基因整合入酵母的染色体基因组后 ,通过营养缺陷型基因或抗性基因进行阳性转化子的筛选。将外源基因阅读框架与信号肽相融合即可... 巴斯德毕赤酵母表达系统可使用强效的醇氧化酶 1(AOX1)启动子 ,在甲醇诱导下实现外源基因的高效表达。外源基因整合入酵母的染色体基因组后 ,通过营养缺陷型基因或抗性基因进行阳性转化子的筛选。将外源基因阅读框架与信号肽相融合即可得到被修饰的分泌型外源目的蛋白。现已有多种方法可进一步提高外源目的蛋白的表达量。 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 分泌型蛋白 甲醇 醇氧化酶 表达载体
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巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展 被引量：65
3
作者 欧阳立明 张惠展 +1 位作者 张嗣良 刘志敏 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2000年第2期151-154,共4页
巴斯德毕赤酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统 ,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点 .综述了该系统在载体类型、载体元件 (包括启动子、选择标记和信号肽序列 )、受体类型。
关键词 巴斯德毕赤酵母 基因表达系统 载体 受体
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人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达 被引量：41
4
作者 贝锦龙 陈庄 +3 位作者 杨林 廖玲 王珣章 蒋宗勇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期254-258,共5页
本文以黑曲霉 (Aspergillusniger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象 ,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列 ,换用在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因 (PhyA as... 本文以黑曲霉 (Aspergillusniger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象 ,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列 ,换用在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因 (PhyA as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS PAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达 ,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌 ,其中SPAN Ⅲ菌株达到了在摇床培养条件下 ,每毫升发酵液产生 16 5 0 0 0u植酸酶的水平 。 展开更多
关键词 基因人工合成 植酸酶基因 phyA-as 毕赤酵母表达系统
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猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用 被引量：19
5
作者 曹瑞兵 周国栋 +2 位作者 周海霞 包晶晶 陈溥言 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期412-417,共6页
为了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。pPICZαA-PIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。多株PCR鉴定为阳性的酵... 为了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。pPICZαA-PIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFN-β,其中B1株酵母的PoIFN-β产量最高,约为2.5×105U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×106U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFN-β阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFN-β理论推导分子量(约20.8kDa)大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFN-β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFN-β对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。 展开更多
关键词 猪β干扰素 毕赤酵母 分泌表达 伪狂犬病毒 抗病毒
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巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望 被引量：20
6
作者 娄瑞娟 罗利龙 +2 位作者 张霞 张瑞刚 宋水山 《生物学杂志》 CAS CSCD 2010年第5期73-76,共4页
巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白。从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如:营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能... 巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白。从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如:营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相关因素,这些因素包括外源基因的特性、基因拷贝数、产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展前景。 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 表达系统 外源基因 高效表达
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猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量：12
7
作者 黄海 谢蓓 +4 位作者 于瑞嵩 刘惠莉 张德福 曹祥荣 李震 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期215-220,共6页
巴斯德毕赤酵母载体质粒 pPICZαA含有强启动子 PAOXⅠ和α MF信号肽序列,构建猪 IFNα基因的重组质粒pPICZαA IFNα,并转入E .coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪 IFNα基因。通... 巴斯德毕赤酵母载体质粒 pPICZαA含有强启动子 PAOXⅠ和α MF信号肽序列,构建猪 IFNα基因的重组质粒pPICZαA IFNα,并转入E .coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪 IFNα基因。通过电击将经 SacⅠ酶切后线性化的 pPICZαA IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母 KM71中。SDS PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪 IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原 抗体反应,表达量为 0.45 mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.1×104 IU/mL。 展开更多
关键词 猪 IFNΑ 巴斯德毕赤酵母 基因重组 分泌表达
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毕赤酵母蛋白表达系统研究进展 被引量：23
8
作者 杨梅 温真 +1 位作者 林丽玉 杨彩云 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期46-51,共6页
选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键。毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多... 选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键。毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质。简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展。 展开更多
关键词 毕赤酵母 表达系统 外源蛋白 载体 研究进展
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毕赤酵母表达系统研究进展 被引量：19
9
作者 齐连权 陈薇 +2 位作者 来大志 于长明 王海涛 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2002年第6期45-47,共3页
毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键... 毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。下面对毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作一简要综述。 展开更多
关键词 毕赤酵母 表达系统 研究进展
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牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定 被引量：12
10
作者 孙自勇 陈均勇 +4 位作者 陈新园 汪晶 田鹏鹏 吴盛 刘建宁 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期41-48,共8页
　用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sephar... 　用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶. 展开更多
关键词 肠激酶 毕赤酵母 分泌表达 纯化 酶切 免疫印迹 丝氨酸蛋白水解酶
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猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用 被引量：11
11
作者 姚清侠 黄勤锋 +3 位作者 曹毅 司有辉 钱平 陈焕春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期451-455,共5页
为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ) ,将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ。将线性化的pPIC9K-mPoIFNγ以化学方法(Li... 为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ) ,将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ。将线性化的pPIC9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型) ,转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株。SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65 %;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106U/mg。 展开更多
关键词 猪Γ-干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性
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猪α干扰素基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达 被引量：8
12
作者 刘健 陈瑞爱 +3 位作者 刘珊珊 朱杰仪 唐明森 罗满林 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期93-97,共5页
根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转... 根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经Zeoc inTM抗性筛选后获得大量多拷贝重组子,SDS-PAGE和W estern-b lot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出相对分子质量约为19 000的PoIFN-α特异蛋白,其有效蛋白表达量较高达54.105 mg/L.经Vero-VSV系统测定,PoIFN-α效价达到5.87×107U/L.试验将PoIFN-α成熟肽全基因密码子进行改造,并实现了其在毕赤酵母菌表达系统中的高效分泌表达. 展开更多
关键词 Α干扰素 密码子改造 毕赤酵母 分泌表达
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猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 被引量：10
13
作者 姚清侠 钱平 +3 位作者 曹毅 徐卓菲 何雁南 陈焕春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1456-1460,共5页
利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母... 利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。 展开更多
关键词 猪α-干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性
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猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析 被引量：6
14
作者 欧阳菁 杨林 +3 位作者 龙綮新 王珣章 邢珂 魏平华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期520-525,共6页
利用含有强启动子PAOX 1 和α MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表... 利用含有强启动子PAOX 1 和α MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut+ ) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N 展开更多
关键词 猪生产激素 巴斯德毕赤酵母 表达载体系统 基因表达 高效分泌表达 N-糖基化分析
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犬α_1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究 被引量：10
15
作者 曹瑞兵 王艳 +1 位作者 魏建超 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期107-112,共6页
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,... 亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。 展开更多
关键词 犬α干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性
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巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景 被引量：15
16
作者 马兴元 谭建华 +1 位作者 朱平 孙曼霁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期98-101,共4页
关键词 巴斯德毕赤酵母 表达系统 外源蛋白生产 应用前景
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猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性 被引量：8
17
作者 姚清侠 曹毅 +4 位作者 钱平 徐卓菲 何雁南 司有辉 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期506-512,共7页
为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法（LiCl）,与... 为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法（LiCl）,与鲑鱼精DNA（ssDNA）共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明：表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%-30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸（pH2）,对热（56℃）部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法（CPE50）测定干扰素抗病毒活性,在MDBK（牛肾细胞系）中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×10^6U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。 展开更多
关键词 猪β-干扰素 毕赤酵母 分泌表达 抗病毒活性 口蹄疫病毒
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黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达 被引量：7
18
作者 朱龙宝 汤斌 +4 位作者 陶玉贵 葛飞 魏胜华 陈涛 李婉珍 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期973-977,共5页
为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体... 为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。 展开更多
关键词 黑曲霉 Β-葡萄糖苷酶 毕赤酵母 基因克隆 分泌表达
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里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在毕赤酵母中的分泌表达 被引量：6
19
作者 欧阳嘉 王向明 +2 位作者 张清 严明 许琳 《林产化学与工业》 EI CAS CSCD 2007年第5期83-88,共6页
采用RT—PCR方法克隆到里氏木霉RutC-30木聚糖酶（XYNⅡ）的cDNA序列。测序结果表明，XYNⅡ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp，编码223个氨基酸，N端1～19个氨基酸为潜在的信号肽序列，删去潜在信号肽序列，将里氏木霉木聚糖酶的基因（... 采用RT—PCR方法克隆到里氏木霉RutC-30木聚糖酶（XYNⅡ）的cDNA序列。测序结果表明，XYNⅡ的cDNA基因开放阅读框长度为669bp，编码223个氨基酸，N端1～19个氨基酸为潜在的信号肽序列，删去潜在信号肽序列，将里氏木霉木聚糖酶的基因（xynⅡ）构建到巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K上，线性化后电击转化到巴斯德毕赤酵母中，经G418筛选和PCR鉴定后的转化子用1％的甲醇进行诱导，对重组木聚糖酶活检测显示该基因能在毕赤酵母中表达有生物活性的XYNⅡ并分泌到胞外。发酵液中的酶活在诱导培养60h达到1．45IU／mL，最适酶解温度为50℃，最适pH值为6．0。 展开更多
关键词 里氏木霉 木聚糖酶 毕赤酵母 分泌表达
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毕赤酵母表达系统 被引量：21
20
作者 韩雪清 刘湘涛 尹双辉 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第4期35-40,共6页
选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响... 选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。 展开更多
关键词 毕赤酵母 表达系统 真核表达系统 基因组表达
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