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核糖体蛋白RPS2对刚地弓形虫体外侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响
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作者 杨晨晨 齐玮瑜 +3 位作者 王晓娟 姜宇宸 李相辰 张莉 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1174-1182,共9页
为研究刚地弓形虫核糖体蛋白RPS2(TgRPS2)对弓形虫侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响,本研究采用系列分子生物学软件分析TgRPS2的生物信息学,通过PCR从弓形虫中扩增TgRPS2基因构建重组表达质粒pET32a-TgRPS2,经双酶切和测序鉴定正确后与p... 为研究刚地弓形虫核糖体蛋白RPS2(TgRPS2)对弓形虫侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响,本研究采用系列分子生物学软件分析TgRPS2的生物信息学,通过PCR从弓形虫中扩增TgRPS2基因构建重组表达质粒pET32a-TgRPS2,经双酶切和测序鉴定正确后与pET-32a分别转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后采用镍柱亲和层析法纯化表达的重组TgRPS2蛋白(r TgRPS2)和空载体蛋白,采用SDS-PAGE检测两种蛋白的表达及纯化效果并经BCA法测定两种纯化蛋白的浓度。将r TgRPS2以300μg的剂量免疫小鼠6次,制备TgRPS2多克隆抗体(PAb),采用western blot鉴定r TgRPS2与弓形虫抗体、弓形虫可溶性蛋白与rTgRPS2 PAb的反应性。结果显示,分别在47.3 ku及18 ku处出现目的蛋白和空载体蛋白条带,且目的蛋白主要以包涵体的形式表达,空载体蛋白以上清形式表达,纯化后二者在相应位置均出现单一目的条带,测得rTgRPS2及空载体蛋白的浓度分别为1 949.54μg/mL和2 827.15μg/mL。Western blot结果显示,rTgRPS2能够与兔源弓形虫PAb反应,rTgRPS2 PAb也可以与弓形虫可溶性蛋白反应。将20μg/mL及不同浓度的rTgRPS2分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养后,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rTgRPS2与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合;利用CCK-8试剂盒及流式细胞术分别检测不同浓度rTgRPS2对巨噬细胞增殖能力、吞噬能力及凋亡的影响,利用ELISA检测各组巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10和转化生长因子β1(TGF-β1)的分泌水平,利用试剂盒检测各组巨噬细胞NO的含量。结果显示,rTgRPS2能够与小鼠巨噬细胞紧密结合,在细胞质中出现红色荧光,而阴性对照及Mock组细胞均无红色荧光。不同浓度的rTgRPS2对巨噬细胞的增殖均无影响。与空载蛋白对照组相比,不同浓度rTgRPS2作用后巨噬细胞Ana-1的吞噬能力均极显著增强(P<0.001);10μg/mL~40μg/mL的rTgRPS2作用后,巨噬细胞Ana-1的凋亡率均极显著升高(P<0.01、P<0.001);不同浓度的r TgRPS2作用后巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-α的分泌水平显著和极显著升高(P<0.05、P<0.001),但促炎细胞因子IL-6的分泌水平无显著变化;5μg/mL和10μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中抑炎细胞因子TGF-β1的分泌水平显著和极显著下降(P<0.05、P<0.01);40μg/mL和80μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中抑炎细胞因子IL-10的分泌水平极显著升高(P<0.001);40μg/mL和80μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中总NO的含量显著和极显著升高(P<0.05、P<0.01)。上述研究结果首次证实rTgRPS2有较强的反应原性,能够与巨噬细胞结合,促进巨噬细胞的吞噬能力与凋亡,并通过多种方式双向调节巨噬细胞的炎症反应及免疫应答方式。本研究为探究弓形虫体内感染巨噬细胞的免疫反应机制奠定基础,也为弓形虫疫苗抗原的筛选、亚单位疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 核糖体rps2蛋白 原核表达 小鼠巨噬细胞 免疫功能
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