谷氨酸棒杆菌人工核糖体结合位点(RBS)文库的建立与应用 被引量：1

1

作者 张悦 张继伟 +3 位作者 吴硕 徐宁 刘君 魏亮 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第23期25-32,共8页

核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)是一种重要的生物控制元件,是实现基因表达精细调控的重要工具,在微生物代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,被广泛应... 核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)是一种重要的生物控制元件,是实现基因表达精细调控的重要工具,在微生物代谢工程和合成生物学中具有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,被广泛应用于多种氨基酸和有机酸的工业化发酵生产。然而目前,关于谷氨酸棒杆菌RBS元件文库的报道仍然较少。该研究基于谷氨酸棒杆菌RBS序列基本特征,设计构建了一个随机RBS文库。利用流式细胞分选技术和96孔板筛选技术,建立了RBS文库高通量筛选方法。通过2步筛选,构建了一个调控范围广,覆盖范围均匀的人工RBS元件文库,调控范围达到29.04倍。利用α-淀粉酶表达系统对构建的人工RBS文库进行测试和表征,结果表明人工RBS文库具有较高的稳定性和通用性。随后该研究将人工RBS文库应用于L-高丝氨酸生物合成途径的调控优化。利用不同强度RBS元件对L-高丝氨酸合成途径关键酶LysCr和Homr进行精细表达调控,获得了具有高效L-高丝氨酸合成能力的最佳组合,L-高丝氨酸产量到达12.7 g/L,比野生型菌株高丝氨酸含量提高了3.6倍。综上所述,该研究构建了一个调控范围广、稳定性高的谷氨酸棒杆菌人工RBS文库,为谷氨酸棒杆菌代谢工程改造和基因精细表达调控提供了有效的控制元件。 展开更多

关键词 谷氨酸棒杆菌 人工核糖体结合位点文库 高通量筛选 L-高丝氨酸

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信号肽筛选和核糖体结合位点优化的组合策略提高角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达 被引量：1

2

作者 谈沐阳 陈希文 +2 位作者 彭政 张娟 张国强 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期8-14,I0001,I0002,共9页

角蛋白酶(keratinase)是一类能够特异性降解角蛋白的蛋白酶,在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外蛋白含量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。前期研究中已经获得了1株重组枯草芽孢杆菌Bacillus s... 角蛋白酶(keratinase)是一类能够特异性降解角蛋白的蛋白酶,在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外蛋白含量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。前期研究中已经获得了1株重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-p43NMK-Ker,在摇瓶水平下,其胞外角蛋白酶活力为10.4 kU/mL,在SDS-PAGE分析中发现角蛋白酶所在条带颜色较浅,说明其胞外表达量较低。该研究考察了信号肽和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)对角蛋白酶胞外表达量的影响。通过枯草芽孢杆菌内源信号肽替换,筛选得到的带有SP_(dacB)的重组菌株的分泌能力显著提升,其胞外角蛋白酶活力达到84.3 kU/mL,约为出发菌株胞外酶活力的8.1倍。在此基础上,通过对RBS进行基于高效突变位点的半理性预测的饱和突变,筛选得到的1株高产菌株R16D12,其胞外酶活力达到109.1 kU/mL,较RBS优化前提高了29%,是出发菌株胞外酶活力的10.5倍。研究结果表明,信号肽筛选和RBS优化的组合策略显著提高了角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的胞外表达量,为后续研究与应用奠定了基础。 展开更多

关键词 角蛋白酶 枯草芽孢杆菌 信号肽 核糖体结合位点

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烟酰胺核糖激酶在大肠杆菌中的高效异源表达、酶学特性分析和发酵工艺探究

3

作者 毛歆安 龚劲松 +4 位作者 苏畅 李恒 徐国强 许正宏 史劲松 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第6期50-57,共8页

烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN),是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选,实现Nrk在大肠杆菌中的可溶表... 烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,Nrk)催化烟酰胺核糖磷酸化生成β-烟酰胺单核苷(β-nicotinamide mononucleotide,β-NMN),是目前生物酶法合成β-NMN的重要途径。该研究通过异源表达体系筛选,实现Nrk在大肠杆菌中的可溶表达,初始酶活力为2.14 U/mL。通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列和启动子优化,将翻译起始速率为35000 a.u.的RBS序列与双启动子P alsR-T7组合,构建的重组菌酶活力可达5.56 U/mL,是初始水平的2.6倍。Nrk酶学性质研究表明,该酶的最适反应条件为50℃,pH 7.0,10 mmol/L Mg^(2+)。最后,对产Nrk重组菌进行培养条件优化,并在5 L发酵罐中进行罐上产酶放大工艺研究,最终使得酶活力达到72.33 U/mL,是摇瓶发酵水平的13倍。该研究显著提升了Nrk在大肠杆菌中的异源表达水平,为β-NMN的生物酶法合成奠定了基础。 展开更多

关键词 烟酰胺核糖激酶 β-烟酰胺单核苷酸 核糖体结合位点 启动子工程 异源表达

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内部核糖体结合位点介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达 被引量：2

4

作者 李计来 崔文禹 +3 位作者 王欣怡 刘敬 郝少杰 徐静 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第12期1252-1257,共6页

目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by ov... 目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC^(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P<0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值>2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。 展开更多

关键词 内部核糖体结合位点 人肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 CHO细胞

原文传递

RNA结合蛋白核仁素:病毒IRES依赖性翻译起始的重要推手 被引量：1

5

作者 HAN SHI-CHONG WANG XIAO JIA GUAN JUN-YONG 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期575-575,共1页

内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)元件是具有多个类似茎环和假结节结构的复杂RNA片段,其通过多重RNA-RNA和/或RNA-蛋白相互作用,为核糖体的着陆提供平台,以起始转录本的翻译过程。当真核细胞处于饥饿、缺氧和病... 内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)元件是具有多个类似茎环和假结节结构的复杂RNA片段,其通过多重RNA-RNA和/或RNA-蛋白相互作用,为核糖体的着陆提供平台,以起始转录本的翻译过程。当真核细胞处于饥饿、缺氧和病毒感染等应激条件下,其主导的翻译机制将由帽子依赖性翻译向IRES依赖性翻译转换。 展开更多

关键词 内部核糖体进入位点 RNA结合蛋白 病毒感染 蛋白相互作用 翻译起始 核仁素 翻译转换 翻译机制

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2016—45改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的方法

6

《药物生物技术》 CAS 2016年第2期182-182,共1页

本方法涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点（RBS）改造技术。将大肠杆菌密码子优化后的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP．2）基因（具有SEQIDNO．1核苷酸序列的DNA）克隆到质粒pET28a... 本方法涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点（RBS）改造技术。将大肠杆菌密码子优化后的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP．2）基因（具有SEQIDNO．1核苷酸序列的DNA）克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中RBS改变为新的RBS（具有SEQIDNO．2核苷酸序列的DNA）得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP01分别导入大肠杆菌BL21得到sHJBMP01和sHJBMP02本方法提供的RBS改造后的sHJBMP02生产rhBMP-2的发酵单位提高到136．3mg／L。 展开更多

关键词 重组人骨形态发生蛋白2 基因工程菌株 结合位点 改造技术 核糖体 RHBMP-2 核苷酸序列 产量

原文传递

鼠疫耶尔森菌基因组核糖体结合部位识别

7

作者 王宇萌 俞东征 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS CSCD 2012年第6期503-505,511,共4页

目的通过统计分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)CO92株中核糖体结合位点(RBS)与翻译起始位点的距离,探索最适合翻译起始的RBS与起始位点的距离。方法通过对鼠疫菌所有拷贝的16SrRNA3′端,及已经通过实验确定的177处RBS进行分析,确定鼠疫菌RBS的... 目的通过统计分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)CO92株中核糖体结合位点(RBS)与翻译起始位点的距离,探索最适合翻译起始的RBS与起始位点的距离。方法通过对鼠疫菌所有拷贝的16SrRNA3′端,及已经通过实验确定的177处RBS进行分析,确定鼠疫菌RBS的序列特征。统计鼠疫菌CO92株中存在的所有RBS序列的位置和数量,及RBS序列与翻译起始序列ATG(GTG,TTG,CTG)的距离。观察已经公布的CO92株的编码序列(CDS)片段前20个碱基序列的特征。结果在CO92的全基因组序列中搜索,共发现可能的RBS结构5081个,2909个后面一段距离内存在开放读码框架,其中1541与标注的CDS相符,535与标注的CDS终止位点相同,但起始位点不同。CO92序列中的3887CDS前面20个碱基中,57.7%含有RBS序列。结论 RBS序列与起始位点间隔7个碱基和8个碱基出现的次数最多;RBS可能作为基因识别的重要指征。 展开更多

关键词 核糖体结合位点 翻译起始 鼠疫耶尔森菌

原文传递

基于表达元件优化提高脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平

8

作者 严茹雪 李越 +4 位作者 牛家峰 陆兆新 孟凡强 朱萍 吕凤霞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第2期41-47,共7页

本研究实现了脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK 1285中的异源表达,但DepB较低的发酵水平限制了其在食品加工和饲料中的应用,可采用转录和翻译相结合的策略提高DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平。首先,... 本研究实现了脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK 1285中的异源表达,但DepB较低的发酵水平限制了其在食品加工和饲料中的应用,可采用转录和翻译相结合的策略提高DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平。首先,选择9个单启动子替换原始启动子P43,其中单启动子P_(spoVG)介导的重组菌经发酵后酶活力最高,酶活力为29.59 U/mL。其次,选择4个具有较高DepB表达水平的启动子(P43、PsacB、P_(spoVG)和P_(aprE))构建16个双启动子系统,其中,DepB在双启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的介导下活力达到最高,为48.87 U/mL。此外,通过对启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的核心区域(-35和-10区)进行优化,Mutant-5酶活力高达69.17 U/mL,是原始菌株(14.45 U/mL)的4.79倍。在此基础上,通过优化启动子P_(spoVG)的核糖体结合位点序列,进一步提高了DepB的表达水平,RBS15酶活力为115.15 U/mL,是原始菌株的7.97倍。研究结果表明,转录和翻译相结合策略是提高重组蛋白发酵水平的有效手段。 展开更多

关键词 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 枯草芽孢杆菌 表达元件 启动子 核糖体结合位点

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表达元件优化促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达

9

作者 程逸凡 张萌 许菲 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期1-9,共9页

重组胶原蛋白是一种具有广泛应用潜力的生物材料,近年来引起了生物医学、组织工程等众多领域的关注。胶原蛋白的3股螺旋结构赋予其独特的生物学功能和生物相容性,但也增加了其在微生物系统中表达的复杂性。该研究以细菌胶原蛋白V-B作为... 重组胶原蛋白是一种具有广泛应用潜力的生物材料,近年来引起了生物医学、组织工程等众多领域的关注。胶原蛋白的3股螺旋结构赋予其独特的生物学功能和生物相容性,但也增加了其在微生物系统中表达的复杂性。该研究以细菌胶原蛋白V-B作为模式蛋白,通过对表达元件的优化,促进重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表达。首先通过启动子筛选和发酵时长优化,获得介导V-B表达的最优启动子tac-R0。接着利用RBS calculator设计核糖体结合位点(ribosomal binding site,RBS)和间隔序列(aligned spacing,AS)的突变文库,得到与tac-R0启动子搭配组合的最优RBS和AS,使V-B的产量提高至514 mg/L。此外,通过多基因表达盒的串联组合策略,将多个目的基因串联,最终V-B的产量较初始水平提高了8.4倍,达697 mg/L,该研究为重组胶原蛋白的工业化生产提供了基础。 展开更多

关键词 重组胶原蛋白 谷氨酸棒杆菌 启动子 核糖体结合位点 串联表达

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基于转录组学挖掘兽疫链球菌内源表达元件及高产透明质酸应用

10

作者 赵锐 狄靖宜 +2 位作者 张广通 刘浩 高伟霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期296-304,共9页

【目的】构建兽疫链球菌内源性表达元件文库,并探究其在提高透明质酸产量中的应用。【方法】通过对兽疫链球菌发酵指数期和平台期进行转录组测序分析,初步筛选32种高、中、低3种强度的启动子与RBS组合(表达元件PR);进一步利用绿色荧光... 【目的】构建兽疫链球菌内源性表达元件文库,并探究其在提高透明质酸产量中的应用。【方法】通过对兽疫链球菌发酵指数期和平台期进行转录组测序分析,初步筛选32种高、中、低3种强度的启动子与RBS组合(表达元件PR);进一步利用绿色荧光蛋白基因转录水平及荧光强度来验证PR元件的强度;最后,利用筛选到的较强元件PR31过表达透明质酸合成关键基因hasA,hasB,hasC,hasD,hasE,并采用2 L发酵罐评价强表达元件在提高透明质酸产量的效果。【结果】上述基因的相对转录水平分别提高至原来的8.17、7.32、3.72、39.48、9倍。其中,过表达hasA及hasD后,透明质酸产量相对于野生型分别提高了43%和31%,达到5.654 g/L和5.283 g/L。【结论】成功构建了兽疫链球菌内源表达元件文库,可用于透明质酸合成途径强化及竞争途径弱化等代谢工程改造。 展开更多

关键词 兽疫链球菌 转录组测序 启动子 核糖体结合位点 透明质酸

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枯草芽孢杆菌高效分泌表达盒的构建和应用

11

作者 韩瑞 初文琴 刘振 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期9-17,共9页

该工作旨在研究枯草芽孢杆菌表达系统中不同元件之间的适配性,从而构建高效蛋白分泌载体,并进一步应用于提高壳聚糖酶Csn21c的胞外表达量。首先,构建包含不同启动子(P43、P_(shuttle09))、核糖体结合位点(RBS1、RBS5)和信号肽(Snpr B、S... 该工作旨在研究枯草芽孢杆菌表达系统中不同元件之间的适配性,从而构建高效蛋白分泌载体,并进一步应用于提高壳聚糖酶Csn21c的胞外表达量。首先,构建包含不同启动子(P43、P_(shuttle09))、核糖体结合位点(RBS1、RBS5)和信号肽(Snpr B、Spho D、Symz C)的12个质粒,并以分别以3种蛋白(琼胶酶Ag WH50C、壳聚糖酶Csn21c和脂肪酶Lip15)为指示蛋白比较不同元件组合的蛋白分泌水平,发现载体p P435Y*K(P43-RBS5-Symz C)和p P095P*K(P_(shuttle09)-RBS5-Spho D)优于其他载体。相较原载体(p P431N*K),载体p P435Y*K能使琼胶酶Ag WH50C酶活性提高184.25%,脂肪酶Lip15酶活性提高52.8%,壳聚糖酶Csn21c酶活性提高164.62%。最后,通过比较5种不同培养基,确定了TB培养基为壳聚糖酶Csn21c的最适发酵培养基,使用TB培养基壳聚糖酶Csn21c的最高酶活力达到21.14 U/m L,较LB培养基的酶活力提高了128.31%。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 分泌 启动子 核糖体结合位点 信号肽 壳聚糖酶

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一种新的双元表达质粒pCMV-Myc-IRES-EGFP的构建及其表达 被引量：10

12

作者 严飞 赵新宇 +1 位作者 邓洪新 魏于全 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期423-428,共6页

为了研究基因的特征、理化特性及其功能机制,通常需要构建多个真核表达载体,涉及到多次的引物设计、酶切、连接和鉴定等繁琐的亚克隆过程。构建携带易于多种实验研究的多用或通用载体是基因工程载体的发展方向。为此,利用pIRES载体为骨... 为了研究基因的特征、理化特性及其功能机制,通常需要构建多个真核表达载体,涉及到多次的引物设计、酶切、连接和鉴定等繁琐的亚克隆过程。构建携带易于多种实验研究的多用或通用载体是基因工程载体的发展方向。为此,利用pIRES载体为骨架质粒,在A和B多克隆位点上分别插入c-Myc标签蛋白序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列,从而构建了一个包含c-Myc标签蛋白序列并携带有核糖体结合位点(IRES)介导的增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pCMV-Myc-IRES-EGFP。通过荧光检测和免疫印迹实验证实该载体能在哺乳细胞中表达。该载体可用于监测细胞的转染效率、分选稳定表达的阳性细胞群体、体外转录和翻译、检测或纯化目的蛋白以及捕获相关作用蛋白等多种实验研究,为基因功能研究提供了便利。 展开更多

关键词 载体构建 绿色荧光蛋白 核糖体结合位点

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启动子对木糖异构酶基因在谷氨酸棒杆菌中表达的影响 被引量：3

13

作者 杨柳 许敬亮 +1 位作者 陈小燕 袁振宏 《新能源进展》 2014年第5期353-357,共5页

以大肠杆菌的强启动子Ptrc和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro作为大肠杆菌的木糖异构酶基因xylA在谷氨酸棒杆菌中表达的转录起始元件,通过实验表明谷氨酸棒杆菌自身的强启动子Pgro能有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒杆菌ATCC 1... 以大肠杆菌的强启动子Ptrc和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro作为大肠杆菌的木糖异构酶基因xylA在谷氨酸棒杆菌中表达的转录起始元件,通过实验表明谷氨酸棒杆菌自身的强启动子Pgro能有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的表达,同时,核糖体结合位点RBS序列的优化对目的基因的表达水平有一定的影响。 展开更多

关键词 谷氨酸棒杆菌 木糖异构酶基因 穿梭表达载体 启动子 核糖体结合位点

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柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析 被引量：1

14

作者 张金 邹红 +1 位作者 姚卫建 聂品 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1100-1107,共8页

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得... 柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TATTTTCG和TTG。将acs的上游调控序列(promoter sequence,Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicol acetyltransferase,cat)的上游并导入柱状黄杆菌G4株后,cat基因得以表达,并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5′RACE技术,确定了外源的cat基因和内源的acs基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游46 bp处的T。通过删减分析调控序列Pacs,发现起始密码子上游164 bp的序列是保持启动子活性所必需的。通过分析和比对32个基因的核糖体结合位点区域,在起始密码子上游10 bp处发现了RBS保守基序TAAAA。 展开更多

关键词 柱状黄杆菌 乙酰辅酶A合成酶基因 启动子 核糖体结合位点

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凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

15

作者 朱惠明 杨俊文 +2 位作者 王娜 蔡筱彦 邓传珍 《现代消化及介入诊疗》 2004年第3期143-145,183,共4页

目的构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体,为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋... 目的构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体,为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点,构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3,将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定,进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果测序结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Noteborn报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端,并构建成凋亡素真核表达载体。 展开更多

关键词 凋亡素 真核表达载体 基因序列 核糖体 质粒 肿瘤细胞凋亡 测序 携带 结合位点 高表达

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枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成α-熊果苷 被引量：6

16

作者 周祺 吕雪芹 +4 位作者 柴雪莹 刘延峰 李江华 堵国成 刘龙 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第22期1-7,共7页

α-熊果苷是一种糖苷类化合物,有较好的抗炎、修复和美白作用。通过生物转化法合成α-熊果苷具有高效、绿色环保的特点。该文以枯草芽孢杆菌为宿主,以对苯二酚(hydroquinone,HQ)和蔗糖为底物,异源表达来源于变异链球菌(Streptococcus mu... α-熊果苷是一种糖苷类化合物,有较好的抗炎、修复和美白作用。通过生物转化法合成α-熊果苷具有高效、绿色环保的特点。该文以枯草芽孢杆菌为宿主,以对苯二酚(hydroquinone,HQ)和蔗糖为底物,异源表达来源于变异链球菌(Streptococcus mutans)的蔗糖磷酸化酶(SmSP^(I336L))作为生物催化剂,全细胞催化高效合成α-熊果苷。首先,通过对蛋白表达能力的比较确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800是合适的宿主菌株,并对SmSP^(I336L)进行启动子优化及多拷贝整合表达,获得全细胞催化合成α-熊果苷的重组B.subtilis,α-熊果苷的产量为54.05 g/L,底物HQ的摩尔转化率为43.7%;然后,通过优化SmSP^(I336L)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列显著提高了α-熊果苷的产量和底物HQ的摩尔转化率,分别达到99.14 g/L和80.15%;最后,对全细胞催化的条件进行优化,扩大催化体系至20 mL并将催化时间从22 h延长至34 h,进一步提高了α-熊果苷的产量且产量稳定,最终优化后的α-熊果苷产量最高达到了119.44 g/L,底物HQ的摩尔转化率为96.56%。该研究成果对α-熊果苷的工业化生产具有重要意义。 展开更多

关键词 α-熊果苷 蔗糖磷酸化酶 核糖体结合位点 序列优化 枯草芽孢杆菌 全细胞催化

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Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略 被引量：5

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作者 余越春 崔文璟 +1 位作者 刘义 周哲敏 《工业微生物》 CAS CSCD 2014年第2期14-19,共6页

针对红球茵低分子量腈水合酶(L-NHase)在重组茵中难以表达这一问题,通过对其α亚基及调控蛋白NhlE基因的核糖体结合位点和α,β亚基间隔序列的长度进行改造,构建了重组表达栽体,实现了L-NHase及其调控蛋白NhlE在E.COli BL21(DE3)中过量... 针对红球茵低分子量腈水合酶(L-NHase)在重组茵中难以表达这一问题,通过对其α亚基及调控蛋白NhlE基因的核糖体结合位点和α,β亚基间隔序列的长度进行改造,构建了重组表达栽体,实现了L-NHase及其调控蛋白NhlE在E.COli BL21(DE3)中过量表达。通过培养条件优化,得到最佳表达条件为:37℃培养茵体浓度(DD_600)到1.0时,加入终浓度为0.1 g/L的COCl_2·6H_2O,0.6 mmol/,L的IPTG,然后在24℃下诱导表达24 h。最终得到的重组蛋白粗酶液的活性为(109.9±5.5)U/mg。采用Strep-tag/Strep-Tactin亲和层析简化了L-NHase的纯化方法,本研究结果为一些难于异源重组表达的多亚基蛋白质的表达具有一定的借鉴意义。 展开更多

关键词 腈水合酶 核糖体结合位点 调控蛋白 重组表达 蛋白质纯化

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γ-谷氨酰转肽酶高效表达及其催化合成γ-谷氨酰苯丙氨酸 被引量：1

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作者 刘栓英 刘会灵 +5 位作者 龙梦飞 武文慧 张显 徐美娟 杨套伟 饶志明 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第18期23-29,共7页

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可催化苦味氨基酸形成氨基酸衍生物,从而降低食物的苦味,在食品行业具有很好的应用前景。为了提高GGT表达量,基于NH+4,邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA),三氯乙酸(trichloroacetic acid... γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可催化苦味氨基酸形成氨基酸衍生物,从而降低食物的苦味,在食品行业具有很好的应用前景。为了提高GGT表达量,基于NH+4,邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA),三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)与二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)之间的显色反应,建立一种用于获得GGT高表达量菌株的高通量筛选方法。易错PCR对HpaII-10区上游的7个碱基进行随机突变,筛选得到EF3HpaII突变体,使GGT表达量较原始启动子提高了63%。建立核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)文库,筛选得到RBS362,与EF3HpaII共同调控ggt表达,可使重组菌GGT表达量提高至60.25 U/mL,是原始菌的2.02倍。GGT催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)合成γ-谷氨酰苯丙氨酸(γ-glutamylphenylalanine,γ-Glu-Phe),在最优条件下:底物浓度为50 mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)和200 mmol/L L-Phe,酶浓度为1 U/mL,初始反应温度35℃,pH 10.0,γ-Glu-Phe最终产率高达94%。 展开更多

关键词 Γ-谷氨酰转肽酶 高通量筛选 启动子 核糖体结合位点 γ-谷氨酰苯丙氨酸

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D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达 被引量：1

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作者 胡梦莹 李梦丽 +1 位作者 江波 张涛 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第18期42-47,共6页

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scin... D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。 展开更多

关键词 D-阿洛酮糖3-差向异构酶 枯草芽孢杆菌 启动子 核糖体结合位点 发酵产酶

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基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

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作者 王亚丽 刘秀霞 +1 位作者 杨艳坤 白仲虎 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第16期1-8,共8页

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表... 水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。 展开更多

关键词 重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ Rhv3) 核糖体结合位点(ribosome binding site RBS) 多拷贝 信号肽 谷氨酸棒杆菌

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