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EC-SOD包涵体的柱上复性、纯化及稳定性研究 被引量：4
1
作者 朱希强 袁勤生 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期101-106,共6页
利用His-tag与金属离子的特异结合作用,通过金属(Ni)亲和层析对EC-SOD包涵体进行柱上复性.考察蛋白上样量、尿素脱除速率和复性温度对复性效率的影响.利用Ni-sepharose和Heparin-sepharose亲和柱对重折叠后的蛋白进行纯化,并研究复性蛋... 利用His-tag与金属离子的特异结合作用,通过金属(Ni)亲和层析对EC-SOD包涵体进行柱上复性.考察蛋白上样量、尿素脱除速率和复性温度对复性效率的影响.利用Ni-sepharose和Heparin-sepharose亲和柱对重折叠后的蛋白进行纯化,并研究复性蛋白的稳定性.结果表明,利用Ni-sepharose亲和柱可以对EC-SOD进行复性,上样量越大,尿素脱除速率越快,复性效率越低;温度升高,复性效率增加.Ni-sepharose对复性后蛋白具有纯化作用,经Heparin-sepharose亲和柱纯化后蛋白比活明显提高.复性蛋白在10℃～50℃温度范围内活性稳定,pH低于5大于10时,其稳定性显著降低,在尿素和盐酸胍溶液中复性蛋白的稳定性较弱. 展开更多
关键词 重组人EC-SOD 包涵体 柱上复性 纯化
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人P53的原核表达及包涵体复性研究 被引量：5
2
作者 刘慧 张守涛 郭亚楠 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2016年第4期112-117,共6页
通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白... 通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础. 展开更多
关键词 P53 包涵体 透析复性 稀释复性 柱上复性
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重组人EGF-IL-18融合蛋白的表达纯化及复性 被引量：4
3
作者 潘建华 彭颖 +1 位作者 郑昭暻 吕建新 《细胞生物学杂志》 CSCD 2006年第5期711-716,共6页
融合基因EGF-IL-18与表达载体pET32a(+)连接构建融合型原核表达质粒pET32a(+)-EGF-IL-18。该基因在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达,SDS-PAGE分析表明表达产物大部分以包涵体形式存在。以2mol/L尿素和1%TritonX-100对包涵体进行反复... 融合基因EGF-IL-18与表达载体pET32a(+)连接构建融合型原核表达质粒pET32a(+)-EGF-IL-18。该基因在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达,SDS-PAGE分析表明表达产物大部分以包涵体形式存在。以2mol/L尿素和1%TritonX-100对包涵体进行反复洗涤后,利用离子交换柱层析对包涵体进行柱上复性,结果表明离子交换层析柱上复性不仅能够获得可溶性的EGF-IL-18融合蛋白,而且产物同时得到纯化,纯度大于90%。复性的EGF-IL-18经分子筛进一步纯化后,体外实验证明具有促进人外周血单个核细胞(PBMC)IFN-g基因表达的能力。该方法简单、高效,为进一步开展EGF-IL-18的动物实验及其大量纯化制备打下基础。 展开更多
关键词 EGF-IL-18融合蛋白 包涵体 离子交换柱层析 柱上复性
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重组毒素DT389-IL13的复性与纯化工艺 被引量：1
4
作者 代新宪 郑妍鹏 郭韶霞 《北京交通大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期118-121,127,共5页
为了获得有较高生物活性的靶向重组毒素DT389-IL13,在大肠杆菌中高效表达DT389-IL13,并采用凝胶过滤的方法对DT389-IL13进行柱上复性及初步纯化,然后使用离子交换色谱方法进一步纯化,最后应用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测DT389-IL13对... 为了获得有较高生物活性的靶向重组毒素DT389-IL13,在大肠杆菌中高效表达DT389-IL13,并采用凝胶过滤的方法对DT389-IL13进行柱上复性及初步纯化,然后使用离子交换色谱方法进一步纯化,最后应用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测DT389-IL13对肿瘤细胞的抑制作用.实验结果显示,经柱上复性和纯化后,DT389-IL13的纯度可达90%以上,且对脑胶质瘤细胞U251有明显的抑制作用,存在明确的剂量依赖关系,48h的半数抑制浓度为8.87×10-10mol/L.表明联合应用凝胶过滤和离子交换两种色谱方法可获得高纯度的复性蛋白,是可行的复性及纯化方案. 展开更多
关键词 生物化学 重组蛋白 蛋白纯化 柱上复性
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人Cε3-Cε4基因克隆、表达及纯化复性 被引量：1
5
作者 刘中成 时海浪 +4 位作者 张艳芬 赵丽君 王培莹 常斌 李雨诗 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期134-139,共6页
利用RT-PCR技术从变态反应疾病患者外周血淋巴细胞中克隆出人Cε3-Cε4基因,将其克隆至原核表达载体pET-17b中,转化大肠杆菌并进行诱导表达,SDS-PAGE后Cε3-Cε4蛋白表达量占细菌总蛋白的30.7%。菌体经裂解、2 mol/L尿素洗涤后,绝大部... 利用RT-PCR技术从变态反应疾病患者外周血淋巴细胞中克隆出人Cε3-Cε4基因,将其克隆至原核表达载体pET-17b中,转化大肠杆菌并进行诱导表达,SDS-PAGE后Cε3-Cε4蛋白表达量占细菌总蛋白的30.7%。菌体经裂解、2 mol/L尿素洗涤后,绝大部分杂蛋白被去除,目的蛋白纯度达85.5%。用8 mol/L尿素溶解包涵体,经Ni-NTA柱对变性状态下的目的蛋白进行纯化,并利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行复性,最终目的蛋白纯度为95.3%。Western blotting方法对Cε3-Cε4蛋白进行鉴定,为该蛋白的进一步相关研究奠定基础。 展开更多
关键词 Cε3-Cε4 表达 柱上复性
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重组人心肌肌钙蛋白I纯化方法的对比
6
作者 郝庆钦 周建平 +4 位作者 许秀丽 刘培 温新宇 王玲 田亚平 《国际检验医学杂志》 CAS 2014年第14期1817-1818,1820,共3页
目的对比两种重组人心肌肌钙蛋白I(rhcTnI)纯化方法,获取稳定的rhcTnI,促进心肌肌钙蛋白(cTnI)诊断标准化的研究。方法超声破碎工程菌获取rhcTnI包涵体,经2%Tritonx-100,2mol/L脲洗涤后溶解在8mol/L脲中,分别经CMFF柱上复性和稀释复性纯... 目的对比两种重组人心肌肌钙蛋白I(rhcTnI)纯化方法,获取稳定的rhcTnI,促进心肌肌钙蛋白(cTnI)诊断标准化的研究。方法超声破碎工程菌获取rhcTnI包涵体,经2%Tritonx-100,2mol/L脲洗涤后溶解在8mol/L脲中,分别经CMFF柱上复性和稀释复性纯化rhcTnI,对比两种方法纯化rhcTnI的获得率及其产物在4、-20、-80℃及冻干条件下的稳定性,确立高效获取稳定的cTnI的纯化方法。结果 0.1g湿重包涵体经CM-FF柱上复性和稀释复性的获得率分别为26.8%和18.9%。4、-20、-80℃及冻干条件下,CM-FF下柱上复性获得的rhcTnI稳定,并且柱上复性纯化周期短,效率高。结论 CMFF柱上复性要比稀释复性纯化rhcTnI高效、稳定。 展开更多
关键词 心肌肌钙蛋白I 稀释复性 柱上复性 纯化
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重组人IL-17A和IL-17F的制备方法及活性测定
7
作者 贾军会 李慎涛 +1 位作者 刘振龙 赵文明 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期137-142,共6页
人IL-17A和IL-17F具有很高的同源性,在炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中都发挥着重要的作用,是当前研究的热点。应用原核表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了人IL-17A和IL-17F;经培养条件的优化,未发现可溶性目的蛋白的表达,免... 人IL-17A和IL-17F具有很高的同源性,在炎症性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤中都发挥着重要的作用,是当前研究的热点。应用原核表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了人IL-17A和IL-17F;经培养条件的优化,未发现可溶性目的蛋白的表达,免疫印记分析显示,重组蛋白位于包涵体中;对包涵体进行洗涤、凝胶过滤层析纯化和柱上复性,获得重折叠的可溶性蛋白;随后用SDS-PAGE对蛋白样品进行了纯度分析、采用免疫印记和质谱的方法鉴定蛋白产物成分、用MC3T3-E1和RAW264.7两个细胞株对IL-17A、IL-17F的生物学活性进行测定。结果显示,柱上复性的方法制备的该重组蛋白具有较高的纯度和活性。建立的重组人IL-17A和IL-17F的制备方法可为相关研究中细胞因子的大量应用提供参考。 展开更多
关键词 IL-17A IL-17F 蛋白纯化 柱上复性 活性测定
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rhFGF4在大肠杆菌中的表达、纯化及其对高糖损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用
8
作者 张煜 吴芬芳 +2 位作者 张梦 田海山 李校堃 《温州医科大学学报》 2021年第7期517-523,共7页
目的:制备、鉴定重组人成纤维细胞生长因子4(rhFGF4)蛋白,观察rhFGF4对高糖损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用及相关分子机制。方法:构建pET3d-hFGF4重组质粒,利用大肠杆菌表达系统高效表达rhFGF4蛋白。可溶性目的蛋白大多以包涵... 目的:制备、鉴定重组人成纤维细胞生长因子4(rhFGF4)蛋白,观察rhFGF4对高糖损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用及相关分子机制。方法:构建pET3d-hFGF4重组质粒,利用大肠杆菌表达系统高效表达rhFGF4蛋白。可溶性目的蛋白大多以包涵体的形式表达,制备方法为建立包涵体清洗、变性及肝素柱柱上复性与纯化。采用MTT法检测rhFGF4蛋白促细胞增殖的生物学活性,建立细胞损伤模型并用Western blot技术检测NF-κB、JNK以及p38蛋白的磷酸化表达。结果:成功构建重组质粒pET3d-hFGF4。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定结果表明,rhFGF4蛋白在大肠杆菌中成功高效表达。细胞实验证实rhFGF4蛋白通过阻止NF-κB、JNK以及p38的磷酸化来修复高糖诱导损伤的HUVEC并抑制其凋亡,降低其MDA、ROS含量。结论:本研究成功得到高纯度并具有生物学活性的rhFGF4蛋白,并证实其对高糖损伤的HUVEC的保护作用与改善氧化应激水平相关。 展开更多
关键词 重组人成纤维细胞生长因子4 柱上复性 人脐静脉内皮细胞 氧化应激 细胞凋亡
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抗胰岛素样生长因子1受体单链抗体复性研究
9
作者 宋永红 张跃栋 +3 位作者 苏县辉 许岩丽 孙雪文 张红艳 《生物技术》 CAS 2018年第5期478-483,466,共7页
[目的]建立抗人胰岛素样生长因子1受体单链抗体包涵体复性方法。[方法]首先,在96孔板上进行稀释复性,从72种复性液中筛选最佳条件。每孔复性液2 m L,滴入起始浓度1. 5 mg/m L的包涵体溶解液100μL过夜复性。然后,选择最佳复性液与变性... [目的]建立抗人胰岛素样生长因子1受体单链抗体包涵体复性方法。[方法]首先,在96孔板上进行稀释复性,从72种复性液中筛选最佳条件。每孔复性液2 m L,滴入起始浓度1. 5 mg/m L的包涵体溶解液100μL过夜复性。然后,选择最佳复性液与变性液混合在Superdex 75柱上形成1 cm柱长下降5%的变性液梯度,样品按5%柱体积上样进行柱上复性。[结果]最适稀释复性液为C8(50 mmol/L Tris-Cl,GSH/GSSG=5/0. 5 mmol/L,0. 4 mol/L精氨酸,p H 9.0),对应复性率约为78%;以该复性液为基础通过柱上复性,目标蛋白复性率提高到95%,复性样品抗原结合活性良好。[结论]建立了目标蛋白包涵体柱上复性方法,复性率达到95%,产量达到384 mg/L。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子1受体 单链抗体 包涵体 高通量 柱上复性
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PCR合成的A型肉毒毒素重链C端结合区基因的高效表达与免疫原性分析 被引量：1
10
作者 杨利敏 王景林 扈庭茂 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期27-31,共5页
目的A型肉毒毒素重链C-端结合区(BoNT/A Hc-C)的PCR拼接合成、重组表达与免疫原性分析。方法经密码子优化软件对编码基因序列重新优化设计,以16条长片段寡核苷酸引物经重叠PCR合成BoNT/AHc-C基因片段,插入表达载体pET-His,再转化大肠杆... 目的A型肉毒毒素重链C-端结合区(BoNT/A Hc-C)的PCR拼接合成、重组表达与免疫原性分析。方法经密码子优化软件对编码基因序列重新优化设计,以16条长片段寡核苷酸引物经重叠PCR合成BoNT/AHc-C基因片段,插入表达载体pET-His,再转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定和抗原性分析。结果表达工程菌裂解液经SDS-PAGE分析,重组蛋白约占细胞总蛋白的65%,为包涵体形式,经亲和层析一步纯化和柱上复性获得纯度大于95%的可溶性重组蛋白,Western blot和ELISA均证明,该重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清抗毒素有特异性结合反应,是BoNT/AHc-C抗原,且免疫小鼠可耐受10个LD50BoNT/A的攻击。结论所获重组BoNT/AHc-C蛋白具有良好的免疫原性,为研制基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 A型肉毒毒素 亲和层析 柱上复性 抗原性
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