柞蚕微孢子虫PCR检测引物的筛选及应用

1

作者 刘微 罗雨桐 +3 位作者 秦子怡 江云敏 唐静雯 王勇 《蚕学通讯》 2024年第4期88-94,共7页

柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)是寄生柞蚕(Antheraea pernyi)并引起微粒子病的主要病原微生物。微粒子病是蚕种生产中的唯一检疫性病害,一旦暴发会严重影响柞蚕产业的健康发展。PCR技术已在病原微生物的检测中被广泛应用。为建立精准、... 柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)是寄生柞蚕(Antheraea pernyi)并引起微粒子病的主要病原微生物。微粒子病是蚕种生产中的唯一检疫性病害,一旦暴发会严重影响柞蚕产业的健康发展。PCR技术已在病原微生物的检测中被广泛应用。为建立精准、高效的柞蚕微孢子虫分子筛查技术体系,对已知柞蚕微孢子虫基因序列的引物进行灵敏度筛选,将不同核酸模板进行梯度稀释后做PCR扩增,电泳对比不同引物扩增的条带亮度与极限检测浓度;选用不同引物对多个感病幼虫的DNA模板开展PCR检测,综合筛选后选取NpSSU rRNA的引物用于后续检测。以50个市售柞蚕蛹的脂肪体分别进行光学显微镜检查和提取DNA后进行PCR扩增,结果显示采用PCR技术能够提高柞蚕微孢子虫的检出率。对70个疑似感染微粒子病的薄皮茧的蛹体开展PCR检测,显示带毒率为51.4%。综上认为,通过筛选适宜的PCR引物应用于柞蚕微孢子虫的检测,对于感染程度低或非孢子期的微孢子虫的检出更加高效、灵敏。 展开更多

关键词 柞蚕微粒子病 柞蚕微孢子虫 PCR检测 引物

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法 被引量：12

2

作者 王伯阳 姜义仁 +4 位作者 臧敏 石生林 杨瑞生 包臣 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期97-101,共5页

利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后,分别采用双抗夹心法和竞争法制作胶体金免疫层析试纸条,建立能简便、快捷、准确诊断柞蚕微粒子病的柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法。双抗夹心法和竞争法分别是将柞... 利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体后,分别采用双抗夹心法和竞争法制作胶体金免疫层析试纸条,建立能简便、快捷、准确诊断柞蚕微粒子病的柞蚕微孢子虫胶体金免疫层析检测法。双抗夹心法和竞争法分别是将柞蚕微孢子虫多克隆抗体与25 nm和17 nm的胶体金颗粒结合并固定在金标垫上,然后均将羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控点(C),但是2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的反应模式不同:前者是以柞蚕微孢子虫多克隆抗体作为检测点(T),而后者以柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为检测点(T)。2种方法制作的胶体金免疫层析试纸条的检测时间均为10 min,检测灵敏度为0.8×107个/mL,与柞蚕血淋巴无交叉反应,特异性强,操作简单,其中,以双抗夹心法制作的试纸条显色更清晰,结果更可靠,更具实用价值。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 多克隆抗体 胶体金 免疫层析 双抗夹心法 竞争法

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用PCR技术检测柞蚕微孢子虫 被引量：10

3

作者 邓真华 姜义仁 +3 位作者 杨瑞生 张涛 秦利 姜德富 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期359-362,共4页

采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增... 采用斑迹抽提法提取柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组DNA,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱中有大小约15kb的清晰、完整条带。选用已报道的微粒子属16S rRNA基因的保守序列设计P1/P2和N1/N22对引物,对柞蚕微孢子虫基因组DNA进行PCR扩增,结果2对引物分别扩增出1条大小不同的特异谱条带,其中用引物N1/N2扩增可检测出0.47ng的DNA模板。应用同样的PCR引物、体系和反应条件,可有效扩增出受感染柞蚕幼虫、成虫中的微孢子虫基因组DNA条带。该项检测技术有望应用于柞蚕微粒子病的早期诊断。 展开更多

关键词 柞蚕 微粒子病 柞蚕微孢子虫 PCR诊断

在线阅读 下载PDF 职称材料

实时荧光定量PCR检测柞蚕微孢子虫的方法 被引量：5

4

作者 米锐 冀万杰 +9 位作者 赵振军 王旭达 李佩佩 李青峰 孙永欣 王鹤 王凤成 李亚洁 朱有敏 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期260-267,共8页

提高柞蚕微孢子虫检测技术的准确性和灵敏度,对控制柞蚕微孢子虫的胚种传染至关重要。以柞蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(SSU rRNA)基因为靶基因,建立柞蚕微孢子虫的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法能够特异性检测柞蚕微孢子... 提高柞蚕微孢子虫检测技术的准确性和灵敏度,对控制柞蚕微孢子虫的胚种传染至关重要。以柞蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA(SSU rRNA)基因为靶基因,建立柞蚕微孢子虫的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法能够特异性检测柞蚕微孢子虫基因组DNA,而对柞蚕基因组DNA无扩增产物。依据标准曲线确定荧光定量PCR的Ct值≤35作为检测的敏感度区间,对柞蚕微孢子虫基因组DNA的最低检出限为0.004 6 ng。应用该方法对100粒柞蚕蛹样本进行检测,共检出54个样本呈柞蚕微孢子虫感染阳性,而采用普通显微镜镜检与采用常规PCR方法检测呈阳性的样本数量分别为2个和34个。应用该方法对生产中的柞蚕种茧和雌蛾进行抽样检测,柞蚕微孢子虫感染阳性检出率显著高于用普通显微镜镜检的阳性检出率(P<0.05)。建立的柞蚕微孢子虫实时荧光定量PCR检测方法提高了检测的灵敏度。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 SYBR Green荧光定量PCR 小亚单位核糖体RNA

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕5龄雌雄个体血淋巴蛋白质含量和组成的变化及差异分析 被引量：5

5

作者 臧敏 秦萍 +4 位作者 王勇 钟亮 秦利 王振东 姜义仁 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期92-96,共5页

以柞蚕5龄幼虫为材料添食柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi,Np),通过测定与分析不同性别5龄幼虫血淋巴蛋白质含量和组成变化的差异,为探究柞蚕对柞蚕微孢子虫感染的免疫应答提供依据。感染柞蚕微孢子虫的不同性别柞蚕5龄幼虫的血淋巴蛋白质... 以柞蚕5龄幼虫为材料添食柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi,Np),通过测定与分析不同性别5龄幼虫血淋巴蛋白质含量和组成变化的差异,为探究柞蚕对柞蚕微孢子虫感染的免疫应答提供依据。感染柞蚕微孢子虫的不同性别柞蚕5龄幼虫的血淋巴蛋白质含量随蚕体发育进程出现不同的变化:雌性个体与雄性个体分别在添食Np后24 h与48 h,血淋巴蛋白质含量极显著增加(P<0.01),且持续至添食后96 h,其中雌性个体的血淋巴蛋白质含量又极显著高于雄性个体(P<0.01);在添食Np后120 h,雌、雄个体的血淋巴蛋白质含量与对照组无显著性差异(P>0.05)。SDS-PAGE分析表明,添食Np后的柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质组成与对照组基本一致,均显示出20条分子质量在20.1～97.2 kD的蛋白条带,其中雌、雄个体在添食后96 h,大小约44 kD的蛋白条带明显加深,大小约28 kD的蛋白条带雌性个体在添食后144 h、雄性个体在添食后120 h明显加深,且雄性个体在添食后120～168 h大小约42 kD的蛋白条带明显加深,但在添食后192 h与对照组无明显差异。研究结果说明Np侵染后,柞蚕5龄幼虫血淋巴蛋白质的含量及组成均产生了一定的变化,并且雌雄个体间的变化存在差异。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 柞蚕5龄幼虫 雌雄个体 血淋巴蛋白质 考马斯亮蓝G-250 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定 被引量：6

6

作者 王伯阳 姜义仁 +3 位作者 杨瑞生 李艳卓 王勇 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期330-336,共7页

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,... 在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫侵染对不同柞蚕品种幼虫生长发育的影响 被引量：3

7

作者 徐亮 陈悦 +4 位作者 孟宪民 宿桂梅 戚俐 焦阳 姜德富 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期172-175,共4页

选择5个柞蚕品种进行柞蚕微孢子虫添毒试验,调查微孢子虫对柞蚕幼虫生长发育的影响及不同品种之间的抵抗能力差异。以浓度为2.4×106mL-1的柞蚕微孢子悬液按照5μL/头的剂量给4龄起蚕添食后,微孢子虫对整个4龄期柞蚕幼虫的生长发育... 选择5个柞蚕品种进行柞蚕微孢子虫添毒试验,调查微孢子虫对柞蚕幼虫生长发育的影响及不同品种之间的抵抗能力差异。以浓度为2.4×106mL-1的柞蚕微孢子悬液按照5μL/头的剂量给4龄起蚕添食后,微孢子虫对整个4龄期柞蚕幼虫的生长发育影响较小(P>0.05);但进入4眠期后微孢子虫侵染对柞蚕幼虫的生长发育产生了明显的影响,幼虫发育迟缓,龄期经过时间延长,蚕体质量最大增加量下降,体质量增速变慢。比较不同柞蚕品种的抵抗能力,发现柞蚕品种582的幼虫生长发育受微孢子虫侵染的影响最小,柞蚕品种青6号和宽青的幼虫生长发育受微孢子虫侵染的影响最大。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 柞蚕幼虫 生长发育 品种差异

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 被引量：2

8

作者 米锐 李亚洁 +4 位作者 孟楠 孙永欣 李学军 温志新 李树英 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期935-939,共5页

柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫... 柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)孢壁蛋白在侵染宿主的过程中扮演重要角色,制备柞蚕微孢子虫孢壁蛋白多克隆抗体可为建立病害的快速诊断技术提供免疫试剂,并有利于研究孢壁蛋白的功能。采用沸水浴法提取柞蚕微孢子虫孢壁蛋白作为抗原免疫新西兰兔,收集纯化血清后得到柞蚕微孢子虫孢壁蛋白抗体。间接ELISA法检测制备的多克隆抗体效价达到1∶2.56×104。采用Western blotting方法在该多克隆抗体与柞蚕微孢子虫孢壁蛋白的免疫反应中检测到分子质量为32 kD的孢壁蛋白。该多克隆抗体对纯化后的柞蚕微孢子虫有较好的检测灵敏度,用于检测感染柞蚕微孢子虫的柞蚕蛹和蛾均呈现阳性结果。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 多克隆抗体 酶联免疫吸附试验 免疫印迹分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫全长cDNA文库的构建及EST分析 被引量：2

9

作者 王勇 姜义仁 +3 位作者 王晓惠 钟亮 黄伶 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期265-271,共7页

柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫（Nosemapernyi）。采用SMART（switchingmechanismat5＇-endofRNAtranscript）技术构建柞蚕微孢子虫全长cDNA文库，初始文库滴度4．2×10^pfu／mL，文库容量1．0×10^7pfu，重组率为98．39％... 柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫（Nosemapernyi）。采用SMART（switchingmechanismat5＇-endofRNAtranscript）技术构建柞蚕微孢子虫全长cDNA文库，初始文库滴度4．2×10^pfu／mL，文库容量1．0×10^7pfu，重组率为98．39％。随机挑取32个克隆，经PCR检测插入的片段长度在750—3000bp之间，平均长度〉1000bp。挑选文库中864个克隆进行表达序列标签（EST）测序，得到626条高质量的EST，拼接后得到197条单一基因（unigenes），包含64条重叠群（contigs）和133条单一EST，冗余度为68．53％。将这些Unigenes与NCBI数据库进行比对，146条Unigenes在蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae）、家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）、兔脑炎微孢子虫（Encephalitozooncuniculi）等的基因组中比对到同源基因。在随机EST测序中克隆获得一个孢子形成蛋白（spomlationprotein）基因，命名为脚s尸一1。该基因ORF长度为1014bp，编码337个氨基酸，蛋白质的理论分子质量为39．2kD，等电点5．71。柞蚕微孢子虫cDNA文库的构建及EST测序的完成，为进一步发现和研究柞蚕微孢子虫的功能基因奠定了基础。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 CDNA文库 表达序列标签 孢子形成蛋白基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫感染后柞蚕卵转录组及免疫相关基因功能分析 被引量：1

10

作者 徐欣 吴玉娇 +5 位作者 于滨 孟宪志 陈杰 刘中文 张永君 潘国庆 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期1560-1569,共10页

【目的】柞蚕微孢子虫Nosema pernyi引发柞蚕Antheraea pernyi微粒子病,威胁柞蚕种质资源的保育及生产安全,并且能够经卵垂直传播,因此需要寻找柞蚕体内应对柞蚕微孢子虫侵染后的免疫基因,为后续寻找和培育抗微粒子病新品种提供帮助。... 【目的】柞蚕微孢子虫Nosema pernyi引发柞蚕Antheraea pernyi微粒子病,威胁柞蚕种质资源的保育及生产安全,并且能够经卵垂直传播,因此需要寻找柞蚕体内应对柞蚕微孢子虫侵染后的免疫基因,为后续寻找和培育抗微粒子病新品种提供帮助。【方法】构建柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组,进行GO功能注释和KEGG分析确定免疫相关基因;PCR克隆柞蚕谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因ApGSTo1并进行生物信息学分析;运用RT-qPCR检测ApGSTo1在柞蚕微孢子虫侵染柞蚕产出后0-10 d卵中的表达量。【结果】在感染与未感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵转录组检测到的表达基因数为17453,其中显著差异表达基因数目为89个;GO功能注释中细胞解剖实体和催化活性相关基因数量最多,KEGG分析中参与运输和分解代谢、信号转导及消化系统这3个通路的基因数量最多。基于柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据分析,将ApGSTo1作为目的基因,PCR克隆及系统进化分析结果证明ApGSTo1属于omega家族GST;感染柞蚕微孢子虫柞蚕卵中ApGSTo1表达量比正常对照组的高,且在产卵后2 d时的表达量极显著高于正常对照组的。【结论】获得了柞蚕微孢子虫侵染后柞蚕卵转录组数据,找到了1个免疫相关基因ApGSTo1,从分子生物学和转录水平初步证明了ApGSTo1参与柞蚕卵内的抗柞蚕微孢子虫侵染,还发现了抗柞蚕微孢子虫侵染反应的关键时间为产卵后2 d时,这些结果为后续研究ApGSTo1在抗逆性和氧化还原等功能方面提供研究基础。 展开更多

关键词 柞蚕 柞蚕微孢子虫 GST ApGSTo1 抗逆性

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因NpSWP1的克隆及序列分析与原核表达 被引量：1

11

作者 文竹 姜义仁 +4 位作者 王斌赫 孙影 李喜升 王勇 秦利 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期688-693,共6页

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕... 微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因。该基因ORF长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量32.02 kD,等电点(pI)7.02。通过Blast比对分析,该基因与家蚕微孢子虫孢子内壁蛋白基因NbSWP1(GenBank登录号:EOB12097.1)的序列相似度为85%,二者编码的氨基酸序列相似度达79%,将该基因命名为NpSWP1(GenBank登录号:KJ573111),初步推测NpSWP1是一种孢子内壁蛋白。将NpSWP1基因与原核表达载体pEASY-E1连接,构建原核表达重组质粒并转化Transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导5 h后,SDS-PAGE和Western blot检测重组菌液能够产生与预期结果相近的大小约32 kD的目的融合蛋白。研究结果有利于进一步开展NpSWP1的细胞定位和功能研究。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 基因克隆 原核表达 免疫印迹分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析 被引量：3

12

作者 张玺 许金山 +1 位作者 张小燕 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期949-956,共8页

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获... 研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 孢壁蛋白 质谱鉴定 孢壁蛋白8 序列分析

在线阅读 下载PDF 职称材料

家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫LINE类反转录转座子R4的鉴定及系统进化分析 被引量：2

13

作者 刘兰兰 吴春漫 +2 位作者 张小燕 许金山 周泽扬 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期681-687,共7页

反转录转座子在物种基因组的进化中发挥重要作用,LINE元件属于non-LTR反转录转座子的类型之一。通过生物信息学分析方法,鉴定了一个全长3 855 bp的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)LINE元件R4Na和一个全长3 970 bp的家蚕微孢子虫(Nosema bom... 反转录转座子在物种基因组的进化中发挥重要作用,LINE元件属于non-LTR反转录转座子的类型之一。通过生物信息学分析方法,鉴定了一个全长3 855 bp的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)LINE元件R4Na和一个全长3 970 bp的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)LINE元件R4Nb。R4Na在柞蚕微孢子虫基因组中有4个呈串联排列的完整拷贝,其余拷贝序列结构和R4Nb的拷贝序列结构有很大差异,显示二者的变异程度很大,暗示2种微孢子虫比较古老。利用转录组高通量测序库比对,R4Nb反转录酶编码区插入的外源序列具有转录活性,暗示这段外源序列可能被招募为外显子。依据LINE元件的反转录酶结构域序列构建2种微孢子虫以及东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、按蚊微孢子虫(Anncaliia algerae)的系统进化树,结果显示R4Na和R4Nb与其它昆虫微孢子虫的R4元件具有一定相似性,而且R4元件家族在昆虫微孢子虫基因组分化过程中形成明显的3个进化群。研究结果证明家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的基因组中均存在LINE类反转录转座子,为研究2种微孢子虫的基因组结构提供了新的线索。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 柞蚕微孢子虫 基因组 LINE类反转录转座子 系统进化

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用生物素标记和蛋白质组学方法分离鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的表面蛋白 被引量：2

14

作者 赵唯希 王林玲 +2 位作者 刘泽锋 周泽扬 李治 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期669-676,共8页

建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和... 建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和2%SDS的混合液裂解结合超声波破碎的方法能提取到更多的微孢子虫总蛋白质;用30%乙腈和70%甲酸配合沸水浴处理可有效洗脱微孢子虫表面蛋白。对得到的柞蚕微孢子虫表面蛋白检测样品进行LC-MS/MS质谱鉴定,共获得了8个假定的表面蛋白,其中分子质量为26.6 k D(Np SWP12)、25.7 k D(Np SWP26)、32.0 kD(Np SWP30)的3个假定蛋白经间接免疫荧光分析确证为定位在孢子表面的蛋白质。序列分析显示,NpSWP12、NpSWP26、NpSWP30与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26、NbSWP30的氨基酸序列相似度分别为100%、93%、79%,其中Np SWP26无N-糖基化位点和O-糖基化位点,但C端具有介导孢子粘附宿主细胞的肝素结合基序。分离鉴定的3个表面蛋白可以作为柞蚕微孢子虫侵染机制研究和早期检测的靶标蛋白。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 表面蛋白 生物素-亲和素系统 液相色谱-二级质谱连用 间接免疫荧光定位

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用荧光定量PCR检测方法对柞蚕不同生产阶段柞蚕微孢子虫发生情况的初步调查 被引量：1

15

作者 米锐 李青峰 +11 位作者 李佩佩 马淑慧 叶博 赵振军 孙永欣 李亚洁 李学军 孟楠 温志新 朱有敏 都兴范 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期837-843,共7页

柞蚕微粒子病是柞蚕生产中重点检测的病害,目前主要采用镜检淘汰带毒母蛾及子代卵的方法进行病害防控,而荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏度,能够有效提高柞蚕生产中对微孢子虫的阳性检出率。应用荧光定量PCR检测方法对来自2个蚕区柞... 柞蚕微粒子病是柞蚕生产中重点检测的病害,目前主要采用镜检淘汰带毒母蛾及子代卵的方法进行病害防控,而荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏度,能够有效提高柞蚕生产中对微孢子虫的阳性检出率。应用荧光定量PCR检测方法对来自2个蚕区柞蚕蛹、蛾的微孢子虫发生情况进行初步调查,同时考察蛹期不同积温发育时期微孢子虫的发生情况以及蛾期亲本带毒对子代卵带毒的影响。结果表明,在蛹期积温中后期(150℃以后)柞蚕微孢子虫的阳性检出率提高,可以考虑在这一发育阶段利用荧光定量PCR方法进行蛹期提前预检;在检验柞蚕微孢子虫垂直传播过程中,发现亲本蛾带毒情况对子代卵带毒存在不同程度的影响,有必要用荧光定量PCR检测方法在卵期对柞蚕微孢子虫进行辅助检测,可以弥补常规蛾期检测的漏检问题。研究结果为应用荧光定量PCR检测技术,在蛹期提前预检以提高种茧品质,在蛾期检测以及卵期辅助检测以减少柞蚕微孢子虫的垂直传播,最终有效控制柞蚕微粒子病的发生提供了参考依据。 展开更多

关键词 柞蚕 柞蚕微孢子虫 荧光定量PCR 发育时期

在线阅读 下载PDF 职称材料

高通量DNA快速提取方法及其在柞蚕微孢子虫分子诊断中的应用

16

作者 李佩佩 岳冬梅 +9 位作者 徐亮 何龙 叶博 赵振军 米锐 张波 王林美 王晓燕 李树英 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期691-698,共8页

针对柞蚕微孢子虫分子检测受限于繁琐的DNA提取而局限于实验室使用的瓶颈问题,以成本较低的碱裂解法结合磁珠抽提,建立了一种全程在96孔板上使用排枪操作的高通量DNA提取方法(HT提取),对比HT-冻融法和HT-SDS法2种裂解方法获得的DNA在常... 针对柞蚕微孢子虫分子检测受限于繁琐的DNA提取而局限于实验室使用的瓶颈问题,以成本较低的碱裂解法结合磁珠抽提,建立了一种全程在96孔板上使用排枪操作的高通量DNA提取方法(HT提取),对比HT-冻融法和HT-SDS法2种裂解方法获得的DNA在常规PCR与荧光定量PCR(qPCR)中的检测下限,并进行微粒子病筛查的应用。结果表明,HT提取法与传统方法相比,无繁琐预处理,操作快速、通量高,污染低、抗干扰、提取DNA品质好,主要耗材能重复使用,可自动化,人力物力成本较低;HT-SDS法具有更稳定的裂解效果,获得的DNA用于常规PCR、qPCR检测下限可达45和0045个/μL;HT-冻融法在常规PCR与qPCR中的检测下限为45和045个/μL,而传统抽提方法的常规PCR检测下限仅为110个/μL。结合HT-SDS法和qPCR,对3 000个样品进行微粒子病筛查,结果显示,其检测灵敏度显著高于现行镜检技术,最高高出近11倍,且对低带毒品种优势尤为显著,有望实现在柞蚕种茧微粒子病检疫及柞蚕种质资源保护中的应用,促进柞蚕业发展。 展开更多

关键词 高通量 DNA提取 柞蚕微孢子虫 分子诊断 高灵敏度

在线阅读 下载PDF 职称材料

四种de novo组装软件对柞蚕微孢子虫全基因组组装结果的比较 被引量：1

17

作者 刘宗林 许金山 周泽扬 《蚕学通讯》 2012年第3期1-5,共5页

柞蚕是一类以柞树叶为食料的经济类吐丝结茧昆虫,柞蚕微孢子是寄生在柞蚕体内的一种微孢子虫,是柞蚕微粒子病的病原,其主要通过食下传染或者母体传染来感染柞蚕。目前在分子水平上对柞蚕微孢子虫的研究还很少,本研究通过比较分析四种常... 柞蚕是一类以柞树叶为食料的经济类吐丝结茧昆虫,柞蚕微孢子是寄生在柞蚕体内的一种微孢子虫,是柞蚕微粒子病的病原,其主要通过食下传染或者母体传染来感染柞蚕。目前在分子水平上对柞蚕微孢子虫的研究还很少,本研究通过比较分析四种常见的de novo组装软件对柞蚕微孢子虫全基因组的组装,结果显示不同的软件组装的结果相差甚远,由此表明由于柞蚕基因组本身结构的特殊性及组装软件的针对性,导致了组装质量的差异性。本研究对于今后昆虫微孢子虫基因组的组装软件的选择优化提供了重要的参考。 展开更多

关键词 微粒子病 柞蚕微孢子虫 DE novo组装 基因组

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫对不同昆虫细胞的感染特性分析 被引量：2

18

作者 岳冬梅 王林美 +5 位作者 李佩佩 叶博 赵振军 张波 李树英 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期699-705,共7页

为建立柞蚕微孢子虫体外培养增殖方法,找到适合微孢子虫增殖的昆虫细胞,将柞蚕微孢子虫接种High5、Sf21和柞蚕卵巢原代细胞后进行显微观察,分析不同昆虫细胞对柞蚕微孢子虫的敏感性。结果发现,柞蚕微孢子虫可以通过吞噬或胞饮作用进入Hi... 为建立柞蚕微孢子虫体外培养增殖方法,找到适合微孢子虫增殖的昆虫细胞,将柞蚕微孢子虫接种High5、Sf21和柞蚕卵巢原代细胞后进行显微观察,分析不同昆虫细胞对柞蚕微孢子虫的敏感性。结果发现,柞蚕微孢子虫可以通过吞噬或胞饮作用进入High5和Sf21细胞中,但在这2种细胞的整个病变过程中,均未观察到孢子增殖阶段的其他形态;柞蚕微孢子虫接种柞蚕卵巢原代细胞后,在细胞病变过程中可以观察到裂殖体、产孢体、孢子母细胞等增殖阶段的孢子形态,后期扩繁的孢子大量形成并释放。结果表明,柞蚕微孢子虫在High5、Sf21这2种细胞中不能扩繁增殖,但可以侵染柞蚕卵巢原代细胞,并大量增殖扩繁。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 昆虫细胞 卵巢原代细胞 感染特性

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫检测方法概述

19

作者 刘玲 杨晓瑜 +5 位作者 程明 郑丹 柯皓天 任建宇 李琼秀 杜国良 《蚕学通讯》 2021年第3期25-27,共3页

柞蚕微粒子病是由柞蚕微孢子虫感染引起的一种危害极大的病害,该病的暴发严重威胁柞蚕生产。本文简要总结了目前检测柞蚕微孢子虫的4种方法,其中普通镜检法在控制柞蚕微粒子病的暴发流行中发挥了重要作用,基于免疫学技术和分子生物学技... 柞蚕微粒子病是由柞蚕微孢子虫感染引起的一种危害极大的病害,该病的暴发严重威胁柞蚕生产。本文简要总结了目前检测柞蚕微孢子虫的4种方法,其中普通镜检法在控制柞蚕微粒子病的暴发流行中发挥了重要作用,基于免疫学技术和分子生物学技术的检测方法具有更高的检测灵敏度和检测效率,但实用化还需要考虑稳定性、通用性和低成本等因素。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 检测方法 普通镜检 胶体金免疫层析 PCR检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

柞蚕微孢子虫体外培养技术体系的建立

20

作者 岳冬梅 王林美 +5 位作者 李佩佩 叶博 赵振军 张波 李树英 范琦 《安徽农业科学》 CAS 2019年第7期124-127,131,共5页

建立了一套柞蚕微孢子虫株分离及体外增殖保存的技术体系。主要方法是利用柞蚕蛹精巢或卵巢组织制备原代细胞,分离、培养柞蚕微孢子虫;利用柞蚕蛹期滞育可以长期储存的特点,将柞蚕原代细胞分离、培养的柞蚕微孢子虫注射入健康柞蚕蛹体... 建立了一套柞蚕微孢子虫株分离及体外增殖保存的技术体系。主要方法是利用柞蚕蛹精巢或卵巢组织制备原代细胞,分离、培养柞蚕微孢子虫;利用柞蚕蛹期滞育可以长期储存的特点,将柞蚕原代细胞分离、培养的柞蚕微孢子虫注射入健康柞蚕蛹体进行继代培养和长期保存;通过原代细胞分离培养、蛹体增殖和保存的交替循环体系,达到分离、增殖及保存微孢子虫株的目的。该技术体系既解决了微孢子虫来源困难,品种混杂不易分离和长期保存等问题,也为进一步探索柞蚕微孢子虫侵染、传播规律和提升柞蚕微粒子病防控效果提供了有力支持。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 培养 技术体系

在线阅读 下载PDF 职称材料