目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病...目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。展开更多
文摘目的探讨蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中的表达。方法PCR扩增蛇毒cystatin基因,将其克隆到pFastBacHTc中,通过转化E.coliDH10Bac筛选克隆,抽提重组Bacmid/cystatin,后者经Cell-fectin介导转染Sf9细胞,获取重组病毒,扩增病毒并感染Sf9细胞进行表达,SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定表达蛋白66。结果获得重组cystatin的杆状病毒,Sf9细胞能表达出与蛇毒cystatin单抗、5×His单抗结合的蛋白,相对分子质量约15 kD。结论蛇毒cystatin在Bac to Bac杆状病毒表达系统中成功表达。
文摘目的探讨重组杆状病毒(baculovirus,Bac)作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的杆状病毒载体(Bac-GFP),以不同感染复数(multiplicities of infection,MOI)的病毒和不同浓度的丁酸钠转染大鼠螺旋神经节细胞,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞转染率和绿色荧光蛋白表达强度,并观察杆状病毒和丁酸钠对螺旋神经节细胞的毒性。结果杆状病毒可以高效转染螺旋神经节细胞,转染效率达77.69%。Bac-GFP 转染率和表达强度随着 MOI和丁酸钠浓度的提高而提高。GFP 在转染后6 h 开始表达,第2天达到最高。重组杆状病毒 MOI 小于800以及丁酸钠终浓度小于或等于10 mmol/L 时,对螺旋神经节细胞没有明显细胞毒性。结论重组杆状病毒可以在体外高效安全转染内耳螺旋神经节细胞。
