绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白基因重组与鉴定 被引量：2

1

作者 万忠海 王景林 +3 位作者 江禹 刘晓明 何畅 朱平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期571-573,共3页

为了获得高表达量重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白 ,以用作免疫原 ,从含有目的片段 (10 0 0 bp)的 p ET- 2 0 (b) +B1 0 质粒切下目的片段 ,以正确阅读框架插入含有 T7lac启动子的 p ET- 2 8c(+) DNA中 ,构建了p ET- 2 8c(+) B... 为了获得高表达量重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白 ,以用作免疫原 ,从含有目的片段 (10 0 0 bp)的 p ET- 2 0 (b) +B1 0 质粒切下目的片段 ,以正确阅读框架插入含有 T7lac启动子的 p ET- 2 8c(+) DNA中 ,构建了p ET- 2 8c(+) B1 0 质粒。用该质粒转化大肠杆菌 BL2 1 (DE3 )、BL2 1 (DE3 ) p L y S,经 IPTG诱导 ,BL2 1 (DE3 ) p L y S能高效表达目的蛋白。 SDS- PAGE、Western blot分析证实 ,该蛋白即是所需的蛋白 ,该重组蛋白占菌体总蛋白的 5 8%。 展开更多

关键词 绿脓杆菌外毒素A 受体结合区 基因重组 鉴定

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艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达 被引量：2

2

作者 杨晓强 赵亚刚 +2 位作者 孙大勇 姜泊 陈学清 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第18期1676-1680,共5页

目的:在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性.方法:提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列(14CDTA),分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳... 目的:在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性.方法:提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列(14CDTA),分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况.结果:成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39.2 ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55.1 ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应.结论:表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础. 展开更多

关键词 艰难梭菌 A毒素 受体结合区 乳链菌

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酵母呈现SARS冠状病毒S蛋白受体结合区及其鉴定 被引量：1

3

作者 张小萍 王靖雪 +2 位作者 郭波 魏静 吴玉章 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期355-357,共3页

目的获得能在酵母表面正确折叠的SARS病毒S蛋白的受体结合区。方法通过PCR技术从pVAX1/S质粒扩增出编码S蛋白318至520氨基酸残基的cDNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体pYD1,构建pYD1-RBD重组质粒,转化酵母细胞,流式细胞仪检测所呈现的RB... 目的获得能在酵母表面正确折叠的SARS病毒S蛋白的受体结合区。方法通过PCR技术从pVAX1/S质粒扩增出编码S蛋白318至520氨基酸残基的cDNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体pYD1,构建pYD1-RBD重组质粒,转化酵母细胞,流式细胞仪检测所呈现的RBD片段。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有RBD片段的表达,并且此表面呈现的RBD片段与针对RBD不同表位的2株单抗均能结合,SARS病毒免疫的小鼠血清抗体也能与该片段结合。结论酵母表面呈现的RBD保持了天然RBD分子的构象,为基于RBD的药物筛选和疫苗设计提供物质基础。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 S蛋白 受体结合区 酵母表面呈现

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A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达 被引量：1

4

作者 余云舟 孙志伟 +1 位作者 王双 俞炜源 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期124-129,共6页

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和... 为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测,结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达;而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒,该重组病毒颗粒感染细胞后,也都能表达Hc抗原。以上结果表明,基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得,为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础,从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。 展开更多

关键词 semliki森林病毒 复制子 A型肉毒毒素 受体结合区Hc 重组病毒颗粒

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B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究 被引量：3

5

作者 杜韫 王文斌 +3 位作者 余云舟 王瑞琳 俞炜源 孙志伟 《生物技术通讯》 CAS 2010年第3期340-342,346,共4页

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/... 目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。 展开更多

关键词 B型肉毒毒素 受体结合区C片段 原核表达 免疫原性

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SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析 被引量：2

6

作者 马翠卿 周育森 +4 位作者 王弋嘉 郭彦 管洁 魏林 何玉先 《中国病毒学》 CSCD 2005年第5期472-475,共4页

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检... 为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应。这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性。将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性。用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体。实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的。提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究。 展开更多

关键词 严重急性呼吸窘迫综合征病毒(SARS-CoV) 刺突蛋白(S蛋白) 受体结合区

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重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性

7

作者 万忠海 金爱军 +3 位作者 谭建华 江禹 刘晓明 朱平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期82-84,共3页

为了观察重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白在不同动物体内的免疫效果 ,将该蛋白纯化后免疫了小鼠、家兔、山羊等动物。对小鼠进行了攻毒实验 ,通过 EL ISA方法检测了家兔、山羊血清中抗体的消长规律。结果对小鼠的保护情况为 :... 为了观察重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白在不同动物体内的免疫效果 ,将该蛋白纯化后免疫了小鼠、家兔、山羊等动物。对小鼠进行了攻毒实验 ,通过 EL ISA方法检测了家兔、山羊血清中抗体的消长规律。结果对小鼠的保护情况为 :最后 1次免疫后 14 d小鼠对 3倍 L D50 的 PEA攻毒保护率为 10 0 % ,2 1d保护率为 5 0 % ,2 8d后无保护效果。家兔和山羊免疫后 7～ 14 d达到峰值 ,2 1d后逐渐降低 ,2 8～ 35 展开更多

关键词 重组绿脓杆菌外毒素A 受体结合区蛋白 免疫活性 免疫效果

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重组含绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白的表达、纯化、复性及细胞生物学活性研究

8

作者 刘晓明 马丛林 +2 位作者 郭学军 朱平 石瑾琪 《生物技术通讯》 CAS 1997年第Z1期107-108,共2页

绿脓杆菌是烧伤及外科手术感染的主要病原菌之一,而绿脓杆菌外毒素A(PEA)是该菌的最主要的毒力因子之一,极微量的PEA便可引起肝、肾等组织细胞死亡,进而导致肝、肾等多器官功能衰竭,这是临床上绿脓杆菌感染后高死亡率的主要原因。同时,... 绿脓杆菌是烧伤及外科手术感染的主要病原菌之一,而绿脓杆菌外毒素A(PEA)是该菌的最主要的毒力因子之一,极微量的PEA便可引起肝、肾等组织细胞死亡,进而导致肝、肾等多器官功能衰竭,这是临床上绿脓杆菌感染后高死亡率的主要原因。同时,PEA还严重影响创口的愈合。目前临床上对于绿脓杆菌感染的控制以及对PEA毒血症的防治尚无有效的方法与手段。 展开更多

关键词 受体结合区蛋白 绿脓杆菌感染 外毒素A 生物学活性 包含体 外科手术 复性 大学研究 细胞死亡 毒力因子

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一种不依赖于活病毒的中东呼吸综合征冠状病毒受体结合区特异性中和抗体检测方法的建立 被引量：1

9

作者 周旋 寇志华 +7 位作者 郭彦 李江凡 何雷 邱洪杰 孙世惠 周育森 赵光宇 杜恩歧 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期447-451,471,共6页

目的拟建立一种不依赖于活病毒和高等级生物安全条件,快速简便检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)受体结合区(RBD)特异性的中和抗体。方法利用哺乳动物表达系统表达重组rRBD-Fc蛋白;应用流式细胞术检测rRBD-Fc蛋白与Huh-7细胞结合的... 目的拟建立一种不依赖于活病毒和高等级生物安全条件,快速简便检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)受体结合区(RBD)特异性的中和抗体。方法利用哺乳动物表达系统表达重组rRBD-Fc蛋白;应用流式细胞术检测rRBD-Fc蛋白与Huh-7细胞结合的最佳浓度,建立通过流式细胞术检测rRBD-Fc与Huh-7结合活性的方法,并利用无关蛋白验证结合的特异性;在此基础上,利用RBD特异性中和抗体、RBD特异性非中和抗体、MERS-CoV RBD免疫小鼠血清和无关抗体建立能够检测中和抗体阻断RBD与Huh-7结合作用的RBD特异性中和抗体检测技术方法,并与实毒中和试验进行比较,评价方法的一致性;应用建立的中和抗体检测方法进行血清学检测。结果成功表达了rRBD-Fc蛋白,rRBD-Fc蛋白能够与Huh-7细胞特异性结合,并确定了rRBD-Fc与Huh-7细胞结合的最佳剂量;在此基础上建立了通过流式细胞术检测抗体阻断RBD与Huh-7结合作用的RBD特异性中和抗体检测技术方法,结果表明,检测方法能够区分具有中和活性的RBD特异性中和抗体、rRBD-Fc免疫小鼠血清和其他抗体,具有特异性,且能够反映中和活性的强弱。该方法在检测12株中和抗体时,与传统的实毒中和试验检测结果具有很好的一致性,能够有效应用于血清学检测。结论成功建立了一种不依赖活病毒和高等级生物安全条件,即可快速检测MERS-CoV RBD特异性中和抗体的方法,为针对MERS-CoV疫苗设计和抗体效果快速评价、血清学调查和免疫保护机制研究提供了一种更加简便、安全的技术手段。 展开更多

关键词 中东呼吸综合征冠状病毒 受体结合区 中和抗体 流式细胞术

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一种展示SARS冠状病毒受体结合区的重组枯草杆菌芽孢的制备及免疫原性分析 被引量：1

10

作者 苗雨 张珍珍 +7 位作者 郭彦 唐健 邱洪杰 于虹 孙世惠 寇志华 赵光宇 周育森 《生物技术通讯》 CAS 2013年第3期342-346,共5页

目的:利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的重组芽孢。方法:将枯草杆菌CotB基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将RBD基因连接到CotB基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY... 目的:利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区(RBD)的重组芽孢。方法:将枯草杆菌CotB基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将RBD基因连接到CotB基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中;利用红霉素抗性筛选重组菌并进行PCR和DNA测序鉴定,Western印迹鉴定重组菌芽孢表面RBD蛋白的表达情况;用表达RBD的重组芽孢以口服方式免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术检测重组芽孢的免疫原性。结果:制备出枯草杆菌基因组整合了RBD抗原基因的重组菌株RS1931,形成的重组芽孢表达相对分子质量约62×103的CotB-RBD融合蛋白;重组芽孢免疫的小鼠血清RBD抗原特异性IgG抗体滴度在末次免疫后2周可达1∶10 880,重组芽孢初免后18周的小鼠脾细胞中IFN-γ+CD4+、IL-4+CD4+和IFN-γ+CD8+T细胞比例上调,表明重组芽孢经口服免疫产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。结论:针对SARS冠状病毒S蛋白RBD建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源RBD蛋白的重组株,获得的重组芽孢具有良好的免疫原性,为开发芽孢呈递型SARS疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 枯草杆菌 芽孢 SARS冠状病毒 受体结合区

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SARS病毒S蛋白受体结合区DNA疫苗及免疫效果研究

11

作者 谢力 肖文珺 +3 位作者 管洁 于虹 赵瑞景 周育森 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期131-134,共4页

目的研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)靶细胞受体结合区所构建之DNA疫苗的免疫效果,为进一步的SARS-CoV免疫机理研究及疫苗研制奠定基础。方法选取SARS-CoVS基因包含靶细胞受体结合区和S1亚单位C端2个基因片段作为目的基因,构建真核表达质粒p... 目的研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)靶细胞受体结合区所构建之DNA疫苗的免疫效果,为进一步的SARS-CoV免疫机理研究及疫苗研制奠定基础。方法选取SARS-CoVS基因包含靶细胞受体结合区和S1亚单位C端2个基因片段作为目的基因,构建真核表达质粒pVAX-RBD(receptor binding domain)、pVAX-S1C作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测其特异性体液免疫及细胞免疫情况。结果体液免疫方面,以SARS全病毒裂解产物和原核表达的RBD蛋白作为诊断抗原,用ELISA均可检测到高滴度的小鼠血清抗体IgG的产生。而且,血清中和试验显示pVAX-RBD质粒激发了小鼠保护性中和抗体的产生。通过流式细胞分析和酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测,pVAX-RBD和pVAX-S1C两组质粒均诱导免疫小鼠产生了特异性细胞免疫反应。结论证明SARS-CoVS蛋白受体结合区上中和表位的存在;体液免疫在抗SARS-CoV感染方面起到重要作用。 展开更多

关键词 SARS冠状病毒 S蛋白 受体结合区 中和抗体 DNA疫苗

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炭疽菌保护性抗原受体结合区的表达及其多克隆抗体的制备

12

作者 邱炎 王艳春 +5 位作者 展德文 陶好霞 姜娜 韩秀萍 李家奎 刘纯杰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期94-98,108,共6页

原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体。从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将... 原核表达炭疽杆菌保护性抗原受体结合区并制备该蛋白的多克隆抗体。从炭疽芽胞杆菌A16R中经PCR扩增得到了炭疽菌保护性抗原(PA)受体结合区基因,即PA的第四结构域(PA-D4),将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-2b(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrapTM Chelating HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western blot检测抗血清。结果表明,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对PA-D4融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1∶102400;其抗体能特异性识别内源性的PA。PA-D4重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能和炭疽疫苗免疫保护机制奠定了基础。 展开更多

关键词 炭疽杆菌 保护性抗原 受体结合区 原核表达 多克隆抗体

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载脂蛋白B-100受体结合区和FDB研究进展

13

作者 李颖 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 1999年第9期39-40,共2页

关键词 载脂蛋白 受体结合区 冠心病 病理学

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基因重组修饰痘苗病毒表达SARS病毒S蛋白产生针对S蛋白受体结合区的保护性抗体

14

作者 孔琪 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2005年第1期26-26,共1页

关键词 SARS病毒 S蛋白 受体结合区 保护性抗体 基因重组修饰痘苗病毒 基因表达

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基于刺突糖蛋白受体结合区的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

15

作者 李静静 刘晓雅 +2 位作者 程英杰 吴常伟 黄恩启 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第12期1484-1489,1494,共7页

目的 建立基于刺突糖蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD)的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体(CB6-HRP)为检测抗... 目的 建立基于刺突糖蛋白(S蛋白)受体结合区(receptor-binding domain,RBD)的重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行方法验证。方法 以GH4人源单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的CB6人源单克隆抗体(CB6-HRP)为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,确定GH4(500、1 000、2 000 ng/mL)及CB6-HRP(3.906 25~500 ng/mL)的工作浓度,并对方法进行线性范围、准确性、精密性、专属性和耐用性验证。采用建立的方法检测3批重组SARS-CoV-2疫苗(CHO细胞)原液的抗原含量。结果 GH4及CB6-HRP的工作浓度分别为1 000和31.25 ng/mL。原液参比品在0.488~125 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系,R~2均> 0.99;准确性验证的回收率在87.2%~120.5%之间;重复性和中间精密性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20.0%;专属性验证的错误率在-16.6%~2.1%之间;耐用性验证的RSD均<20.0%。3批疫苗原液抗原含量分别为638.9、592.4、664.8 ng/mL,RSD为5.8%。结论 建立的基于S蛋白RBD的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的准确性、精密性、专属性和耐用性,可用于重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的检测,为该疫苗的质量控制奠定了基础。 展开更多

关键词 重组SARS-CoV-2疫苗 刺突糖蛋白 受体结合区 双抗体夹心ELISA法 抗原含量

原文传递

基于受体结合区(RBD)的ELISA在MERS-CoV抗体检测中的应用评价 被引量：2

16

作者 王文玲 杨韧 +4 位作者 宋倩倩 王慧娟 邓瑶 赵莉 谭文杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期763-770,共8页

目的比较中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不同形式受体结合区(receptor binding domain,RBD)蛋白在抗体检测中的应用特点.方法以293T和ExpiCHO-STM系统表达并纯化制备MERS-CoV RBD,采... 目的比较中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)不同形式受体结合区(receptor binding domain,RBD)蛋白在抗体检测中的应用特点.方法以293T和ExpiCHO-STM系统表达并纯化制备MERS-CoV RBD,采用非变性凝胶电泳和Western blot对纯化RBD蛋白进行鉴定.然后以等量的上述RBD蛋白或昆虫细胞表达的RBD作为包被抗原,建立间接酶联免疫检测方法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA),用于MERS-CoV IgG抗体检测.同时以商品化的欧蒙MERS-CoV IgG抗体检测试剂盒(以S1为包被抗原)为对照,利用WHO提供的MERS-CoV抗体参比品对基于不同RBD蛋白抗原的ELISA方法进行应用效果比较分析.结果采用293T和ExpiCHO-STM系统成功制备MERS-CoV RBD单体/聚体抗原;不同来源与形式的RBD抗原均能特异识别MERS-CoV特异抗体,与正常成人血清无交叉反应;基于RBD所建立的ELISA应用于MERS-CoV抗体参比品检测,与欧蒙商品化试剂盒检测结果具有较好的一致性,但RBD-T4f、RBD-GCN4聚体RBD检测阳性标本的读值高且较集中,单体/二聚体RBD(昆虫细胞或哺乳动物细胞)阳性标本的读值低且较分散.结论建立了基于MERS-CoV不同单体与聚体RBD蛋白抗原的间接ELISA检测方法,可替代欧蒙商品化试剂盒用于临床检测MERS-CoV特异IgG抗体.RBD-T4f、RBD-GCN4包被抗原的应用结果优于RBD抗原. 展开更多

关键词 中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV) 受体结合区(RBD) 抗体 酶联免疫吸附试验(ELISA)

原文传递

SARS亚基疫苗-突刺蛋白受体结合区RBD在烟草叶绿体中的高效表达 被引量：1

17

作者 钟雪 齐广勋 +3 位作者 杨静 邢国杰 刘剑锋 杨向东 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期920-930,共11页

叶绿体表达系统为植物源重组药用蛋白和亚基疫苗的生产提供了一个有效的途径。为验证SARS亚基疫苗在叶绿体中表达的可行性,以及为植物源SARS亚基疫苗的生产提供一套高效、低成本的技术平台,本研究将人工优化合成的SARS-CoV突刺蛋白(S蛋... 叶绿体表达系统为植物源重组药用蛋白和亚基疫苗的生产提供了一个有效的途径。为验证SARS亚基疫苗在叶绿体中表达的可行性,以及为植物源SARS亚基疫苗的生产提供一套高效、低成本的技术平台,本研究将人工优化合成的SARS-CoV突刺蛋白(S蛋白)受体结合区序列RBD与载体分子CTB融合基因导入烟草叶绿体基因组中。PCR和Southern杂交分析表明,外源融合基因已整合到烟草叶绿体基因组中,并获得同质化。Western杂交分析表明,重组融合蛋白CTB-RBD在叶绿体转基因烟草中获得表达,且主要以可溶性单体形式存在。ELISA分析表明,在不同生长阶段、不同生长部位和不同时间点烟草叶片中,重组融合蛋白CTB-RBD的表达水平呈现明显的变化。重组蛋白在成熟叶片中的表达水平最高可以达到10.2%TSP。本研究通过SARS亚基疫苗RBD在烟草叶绿体中的高效表达,有望为植物源SARS亚基疫苗的生产以及SARS血清抗体的检测提供一个有效的技术平台。 展开更多

关键词 突刺受体结合区RBD SARS 植物源亚基疫苗 叶绿体表达系统

原文传递

中东呼吸综合征冠状病毒刺突蛋白受体结合区蛋白的原核表达纯化及鉴定

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作者 卢帅 蓝佳明 +4 位作者 陈迎珠 周剑芳 秦堃 楼永良 谭文杰 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期98-102,共5页

目的对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS—CoV）刺突蛋白受体结合区（RBD）蛋白进行原核表达、纯化与鉴定及抗原性初步研究。方法人工合成密码子优化的MERS—CoVRBD编码基因，克隆至pET30a（＋）载体，构建重组表达质粒，转化至BL21（DE3... 目的对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS—CoV）刺突蛋白受体结合区（RBD）蛋白进行原核表达、纯化与鉴定及抗原性初步研究。方法人工合成密码子优化的MERS—CoVRBD编码基因，克隆至pET30a（＋）载体，构建重组表达质粒，转化至BL21（DE3）。利用IPTG诱导，探索优化表达条件，并用镍离子亲和层析纯化，SDS—PAGE和Westernblot进行鉴定，并采用间接ELISA对原核表达的RBD进行抗原活性和特异性初步分析。结果重组RBD蛋白主要以包涵体形式表达，以37℃0．5mmol／LIFFG诱导4h表达量最高；变性复性后纯化获得了较纯的重组RBD蛋白，相对分子质量大小约为29×10^3，与预期一致；Westernblot表明其能与感染MERS—CoV的小鼠血清发生特异性反应；间接ELISA显示原核表达RBD蛋白在检测正常和MERS—CoV感染患者血清方面表现出较好的抗原活性和特异性。结论本研究首次利用原核表达系统成功表达并纯化获得重组MERS—CoVRBD蛋白，为MERS—CoV的免疫学检测及疫苗学研究提供了基础。 展开更多

关键词 中东呼吸综合征 冠状病毒 受体结合区 原核表达 纯化 鉴定

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炭疽保护性抗原受体结合区的关键氨基酸位点分析

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作者 葛猛 徐俊杰 +5 位作者 于少洋 董大勇 李冠霖 赵剑 付玲 陈薇 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期865-868,共4页

目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点。方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响。同时... 目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点。方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响。同时对Asp683的一些邻近氨基酸进行了定点突变的研究。结果细胞毒性实验显示,不同的突变导致了PA活性不同程度的下降,其中Asp683电荷的改变对其活性的影响尤为明显,但当它突变为不带电荷的氨基酸时,PA仍然保留了一定的活性;而当Asp683突变为带正电的Lys后,PA却保留了相对较高的活性。结论Asp683所带的负电荷在PA与其受体的相互作用中起着关键的作用,但PA与其受体之间的相互作用可能还通过一些其他方式进行。 展开更多

关键词 炭疽保护性抗原 受体结合区 定点突变 细胞毒性实验

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人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定 被引量：2

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作者 常慧 伊瑶 +7 位作者 赵敏 周为民 赵国霞 王慧娟 毕胜利 高基民 刘冰 谭文杰 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期106-111,共6页

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子... 人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。 展开更多

关键词 HCoV NL63 受体结合区蛋白 重组蛋白 表达 大肠杆菌

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