一种酿酒酵母组成型分泌表达载体的构建及应用

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作者 王国平 欧阳蓓 +2 位作者 胡紫艳 刘启铃 赵喜华 《江西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2024年第5期509-513,共5页

该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制... 该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制元件以及URA3筛选标记所组成.将草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶与pYAT21连接并转化到酿酒酵母中,其发酵上清液粗酶活达到106.8 U·mL^(-1).酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21可应用于异源蛋白的组成型分泌表达. 展开更多

关键词 酿酒酵母 组成型分泌表达载体 异源蛋白

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一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建 被引量：7

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作者 赵颖怡 梁世中 +1 位作者 黄鲲 黄日波 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期431-435,共5页

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列 (INU) ,将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2 ,得到一套新型的分泌表达载体pYES2 I,pYES2 Ⅱ ,pYES2 Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因 (ASN)和短芽孢杆菌α 乙酰乳酸... 用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列 (INU) ,将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2 ,得到一套新型的分泌表达载体pYES2 I,pYES2 Ⅱ ,pYES2 Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因 (ASN)和短芽孢杆菌α 乙酰乳酸脱羧酶 (ALDC)基因 ,连接到INU下游 ,得到重组质粒pASN和pALDC。分别将这两个重组质粒转化酿酒酵母菌株IN VScⅠ中表达 ,胞内和胞外的酶活分析表明ASN和ALDC基因都能在酿酒酵母中分泌表达 ,表明菊粉酶信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组蛋白分泌到胞外。稳定性分析表明 ,重组酵母菌株在没有选择压力的条件下连续接种培养 1 0 0h 。 展开更多

关键词 酿酒酵母 附加型 分泌表达载体 构建 信号肽

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尖孢镰刀菌Six1d启动子的克隆及其在真菌分泌表达载体构建中的应用 被引量：3

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作者 彭存智 常丽丽 +3 位作者 王丹 黄超 徐兵强 仝征 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期1203-1213,共11页

前期研究中构建的真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP可在真菌中表达目标蛋白,在真菌侵染并定殖植物的过程中分泌目标蛋白到植物中,从而验证目的基因的功能,但p74HSP-EGFP载体中驱动目的基因表达的毒素基因(toxin A,ToxA)启动子不是尖孢镰刀... 前期研究中构建的真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP可在真菌中表达目标蛋白,在真菌侵染并定殖植物的过程中分泌目标蛋白到植物中,从而验证目的基因的功能,但p74HSP-EGFP载体中驱动目的基因表达的毒素基因(toxin A,ToxA)启动子不是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)自身的启动子。为能在Foc中更有效地表达其自身基因,本研究从尖孢镰刀菌1号生理小种(Foc1)中克隆到高丰度表达的木质部分泌蛋白基因(secreted in xylem 1d, Six1d)的启动子,来替换p74HSP-EGFP载体中的ToxA启动子,并将新构建的真菌分泌表达载体命名为pSix1d74HSPG。为比较2个分泌载体的表达效率,本研究进一步将p74HSP-EGFP和pSix1d74HSPG载体转化尖孢镰刀菌热带4号生理小种(Foc TR4),获得的转化菌株分别在钾盐液体培养基(KK)中振荡培养5 d后,检测分泌到胞外的EGFP荧光强度和EGFP蛋白的表达量。结果显示,pSix1d74HSPG中Six1d启动子驱动的EGFP表达强度能够达到p74HSP-EGFP中ToxA启动子驱动的1.6~1.7倍,说明pSix1d74HSPG载体可代替p74HSP-EGFP载体在Foc中更高效分泌表达目的蛋白,为香蕉枯萎病抗感病分子机理研究提供重要的实验工具。 展开更多

关键词 香蕉枯萎病 内源启动子 分泌表达载体 Six1d蛋白

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短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建 被引量：4

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作者 彭清忠 张惟材 朱厚础 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期438-441,共4页

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌 5 0中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列 ,利用它与质粒pUB110和pKF3一起构建成穿梭分泌表达载体pBKE5 0。将α 淀粉酶基因引入该载体转化短短小... 应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌 5 0中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列 ,利用它与质粒pUB110和pKF3一起构建成穿梭分泌表达载体pBKE5 0。将α 淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌 5 0后 ,发现α 淀粉酶可以活性形式分泌表达。此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。 展开更多

关键词 短短小芽孢杆菌-大肠杆菌 穿梭分泌表达载体 构建

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E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达 被引量：2

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作者 张宏权 王允玲 +3 位作者 周廷冲 王会信 刘农乐 蒋滋慧 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第4期371-376,共6页

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ... 采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点，在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点，组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体，使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达，另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。 展开更多

关键词 表皮生长因子 大肠杆菌 分泌表达载体

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人bFGF卵清蛋白分泌表达载体的构建及分析

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作者 王海军 王艳芳 +3 位作者 江莺 赵文杰 任艳 马吉胜 《黑龙江医药》 CAS 2010年第3期328-331,共4页

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础。方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,... 目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础。方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,利用重叠PCR技术,将溶菌酶信号肽(lysozyme signal peptide)基因与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因融合在一起。结果:经DNA测序和核酸电泳检测,OV启动子基因序列、pcsbFGF和pcOV-sbFGF电泳位点与预计结果一致。结论:人bFGF的卵清蛋白分泌表达载体构建初步完成,可进行进一步转染表达。 展开更多

关键词 BFGF 卵清蛋白 分泌表达载体 生物反应器

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一种可用于外源基因功能鉴定的真菌分泌表达载体74HSP-EGFP的构建及验证 被引量：1

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作者 王丹 彭存智 +3 位作者 常丽丽 郑杏梅 徐兵强 仝征 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期230-236,共7页

传统的植物遗传转化体系能够鉴定植物基因的功能,但该过程烦琐、耗时长,且存在一定的局限性。本研究构建具有蛋白分泌信号肽和荧光蛋白EGFP的真菌分泌载体74HSP-EGFP,通过尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc... 传统的植物遗传转化体系能够鉴定植物基因的功能,但该过程烦琐、耗时长,且存在一定的局限性。本研究构建具有蛋白分泌信号肽和荧光蛋白EGFP的真菌分泌载体74HSP-EGFP,通过尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)携带侵染巴西蕉(Musa nana)植株对载体上的外源基因功能进行快速鉴定。利用蛋白质组学技术鉴定获得来源于香蕉枯萎病致病菌Foc的主要分泌蛋白Secreted in xylem 1(SIX1d) N端分泌信号肽。基于pCT74载体、SIX1d分泌信号肽序列以及供外源基因插入的多克隆位点序列构建真菌分泌表达载体74HSP,将EGFP基因通过多克隆位点插入到该载体中获得分泌载体74HSP-EGFP。转化Foc后发现,Foc分泌载体74HSP-EGFP转化菌株在PDA培养基和KK培养基中生长4 d后,菌体中无绿色荧光信号,培养基中检测到绿色荧光信号。转化菌株侵染巴西蕉后,在植株根部组织切片中检测到绿色荧光信号。研究结果表明分泌载体74HSP-EGFP能够利用病原菌将携带的外源蛋白表达并分泌到被侵染的植物体内,实现对外源基因功能的快速分析。 展开更多

关键词 分泌表达载体 真菌 功能验证

原文传递

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建 被引量：3

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作者 杨湘越 兰小鹏 +4 位作者 冯福英 吴文冰 钟智强 廖剑 朱忠勇 《实用医学杂志》 CAS 2006年第22期2575-2577,共3页

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提... 目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。 展开更多

关键词 干燥综合征 毕赤酵母 分泌型表达载体

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hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达 被引量：1

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作者 吴海涛 胡云龙 +3 位作者 刁振宇 金丽娜 李洁 张双全 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2004年第2期81-86,共6页

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突... 本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL . 展开更多

关键词 HSBLYS CHO 基因表达 信号肽 分泌型表达载体 免疫调节因子

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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选 被引量：1

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作者 杨湘越 武圣明 +1 位作者 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期695-696,共2页

关键词 Annexin32 酵母分泌型表达载体 构建 高拷贝转化子 快速筛选 毕赤酵母 G418抗性筛选

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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量：3

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作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多

关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌型真核表达载体 真核表达

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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量：1

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作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点... 应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。 展开更多

关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应

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1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建 被引量：1

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作者 赵丽娟 陈源红 +2 位作者 唐华英 韦红玉 曾怡 《微创医学》 2012年第4期347-350,共4页

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载... 目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。 展开更多

关键词 人类免疫缺陷病毒1型 TAT基因 分泌型真核表达载体

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人血管抑素基因分泌型融合载体的构建与表达

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作者 王瑞珉 靳秋月 +1 位作者 程世翔 陈立军 《武警医学院学报》 CAS 2005年第3期178-180,F002,共4页

【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载... 【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载体,回收纯化后做定向克隆连接,转化E.coliDH5α;XbaⅠ及EcoRⅠ双酶切电泳与测序鉴定pEZZ18-As;诱导培养重组菌,表达目的蛋白。【结果】酶切pEZZ18-As,电泳分析插入片段长度为1111bp,与预期结果一致,对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确;SDS-PAGE分析诱导培养重组菌,新出现的蛋白大小约61kD,与预期相符。【结论】成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白,该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。 展开更多

关键词 血管抑素 分泌型融合表达载体 抗血管生成

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可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体 被引量：2

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作者 张超 刘刚 +1 位作者 余少文 邢苗 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期52-58,共7页

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点... 从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体(毕赤酵母表达型T载体),并通过表达重组纤维二糖水解酶II对该载体进行了检验。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片段的上游含XhoI和Eam1105I酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaI酶切位点。通过XhoI和XbaI位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105I酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因(cbh2)的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余氨基酸。 展开更多

关键词 纤维二糖水解酶 巴氏毕赤酵母 分泌型表达载体 里氏木霉 T-载体

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分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

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作者 郝婷婷 马新廷 +1 位作者 朱小飞 卢春 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2012年第1期14-18,共5页

目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,... 目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法:利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果:限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef-EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论:成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef-EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。 展开更多

关键词 分泌性表达载体 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型负性调节因子 增强型绿色荧光蛋白 融合蛋白

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抗菌肽A-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与初步分泌表达 被引量：6

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作者 李燕红 刘飞鹏 +2 位作者 朱嘉明 周天鸿 李月琴 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 1999年第5期88-91,共4页

采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点... 采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点之间，并对其在 Ｌｐｐ启动子和 Ｌａｃ 启动子／ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛（ Ｄｉｇ） 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功； 展开更多

关键词 抗菌肽A 蜂毒素 大肠杆菌 分泌表达载体

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大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达 被引量：4

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作者 马红丹 张丽媛 +4 位作者 赵邯郸 徐丹丹 曲静 关淑艳 王丕武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第1期135-139,共5页

为使大豆锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,Mn SOD)在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的Mn SOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒p NZ8149和经改造的质粒p NZS上,表达载体p NZ-SOD和分泌表达载体p NZS-SOD,将两者分别以电穿孔法... 为使大豆锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,Mn SOD)在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的Mn SOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒p NZ8149和经改造的质粒p NZS上,表达载体p NZ-SOD和分泌表达载体p NZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L.lactis NZ3900/p NZ-SOD和L.lactis NZ3900/p NZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和酶活性对比分析。结果显示:L.lactis NZ3900/p NZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L.lactis NZ3900/p NZ-SOD菌株的1.6倍,是L.lactis NZ3900/p NZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L.lactis NZ3900/p NZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。 展开更多

关键词 锰超氧化物歧化酶(Mn SOD) 食品级分泌表达载体 乳酸乳球菌

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人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

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作者 王广兰 宫璀璀 +3 位作者 刘亚利 初霞 王文丽 李璇 《实用医药杂志》 2009年第11期61-63,66,共4页

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1... 目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。 展开更多

关键词 可溶性1型补体受体1 毕赤酵母细胞 G418抗性筛选 分泌型表达载体

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MMP-9信号肽高效诱导PEX重组蛋白在COS7细胞中分泌表达 被引量：3

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作者 宋琳 张志谦 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期1-5,共5页

为了便于收集和纯化,重组蛋白常需要引导至真核细胞外。蛋白能否分泌主要取决于其是否含有信号肽,由于不同信号肽诱导蛋白分泌的效率不同,高效信号肽的筛选已成为生物工程领域提高重组蛋白产量的重要策略之一。为了筛选诱导MMP-2C末端PE... 为了便于收集和纯化,重组蛋白常需要引导至真核细胞外。蛋白能否分泌主要取决于其是否含有信号肽,由于不同信号肽诱导蛋白分泌的效率不同,高效信号肽的筛选已成为生物工程领域提高重组蛋白产量的重要策略之一。为了筛选诱导MMP-2C末端PEX在COS7细胞中高效分泌表达的信号肽,在PEX的N末端分别融合大鼠生长激素(rGH)、小鼠IgGκ链和人基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)的信号肽并比较三种信号肽引导PEX分泌表达的效率。Western免疫印迹和ELISA蛋白定量检测表明MMP-9的信号肽引导PEX蛋白分泌的效率约为其它两种信号肽的两倍。利用Ni-NTA亲和柱对细胞培养基中的PEX进行纯化,蛋白产量约为1mg/L,纯化的PEX重组蛋白具有抑制鸡尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)血管发生的作用。以上结果提示MMP-9的信号肽有效诱导具有生物活性的PEX重组蛋白在COS7细胞中分泌表达。 展开更多

关键词 基质金属蛋白酶-9 信号肽 分泌表达载体 PEX

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