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甲基转移酶3对人脑血管平滑肌细胞基因表达及增殖和迁移功能的影响
1
作者 孟晨曦 孙洪英 +3 位作者 张佳 毛戬 杨阳 策乐木格 《中国卒中杂志》 北大核心 2025年第1期104-111,共8页
目的探究甲基转移酶3(methyltransferase3,METTL3)对人脑血管平滑肌细胞(humanbrain vascular smooth muscle cells,HBVSMC)基因表达以及增殖和迁移功能的影响。方法采用小干扰RNA(smallinterferingRNA,shRNA)干扰技术,构建METTL3基因... 目的探究甲基转移酶3(methyltransferase3,METTL3)对人脑血管平滑肌细胞(humanbrain vascular smooth muscle cells,HBVSMC)基因表达以及增殖和迁移功能的影响。方法采用小干扰RNA(smallinterferingRNA,shRNA)干扰技术,构建METTL3基因干扰载体并通过腺病毒感染HBVSMC,依据感染情况将其分为空白组(无病毒感染)、对照组(空载病毒感染)和干扰组(METTL3-shRNA病毒感染)。使用逆转录实时定量PCR(real-timereversetranscriptionalPCR,RT-qPCR)检测各组细胞脑小血管病相关基因锌指蛋白395(zincfingerprotein395,ZNF395)、锌指蛋白548(zinc finger protein 548,ZNF548)、DIS3样外泌体3’-5’核糖核酸外切酶(DIS3-like exosome3’-5’exonuclease,DIS3L)、白细胞介素增强子结合因子3(interleukinenhancerbindingfactor3,ILF3)和G蛋白偶联受体107(Gprotein-coupledreceptor107,GPR107)的mRNA表达水平,通过RNA甲基化免疫共沉淀(methylatedRNAimmunoprecipitation,MeRIP)技术检测以上基因mRNA的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰水平,利用细胞计数试剂盒8(cellcountingkit8,CCK8)、Transwell小室实验检测各组HBVSMC的增殖和迁移能力。结果与空白组相比,对照组细胞各基因的mRNA相对表达水平未发生明显改变。与对照组相比,干扰组细胞ZNF395(P=0.02)、ZNF548(P=0.03)、DIS3L(P=0.02)和GPR107(P<0.01)的mRNA相对表达水平,以及ZNF395(P<0.01)和ZNF548(P<0.01)的m6A修饰水平均降低。与对照组相比,干扰组HBVSMC的增殖和迁移能力明显增强。结论在HBVSMC中干扰METTL3基因表达可能通过下调靶基因ZNF395和ZNF548mRNA的m6A修饰水平进而增强HBVSMC的增殖和迁移能力。 展开更多
关键词 甲基转移酶3 人脑血管平滑肌细胞 N6-甲基腺苷 增殖 迁移
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过氧亚硝酸盐增强人脑血管平滑肌细胞PDCD4基因表达 被引量：1
2
作者 李林 陈晓锐 +4 位作者 宋莎莎 焦玉莲 马春燕 鞠远荣 李建峰 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2010年第9期956-960,共5页
目的探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HCVSMCs)凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的HCVSMCs系为实验材料,观察不同浓度的ONOO-对HCVSMCs的作用。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞... 目的探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HCVSMCs)凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的HCVSMCs系为实验材料,观察不同浓度的ONOO-对HCVSMCs的作用。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,吖啶橙染色、Ho33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western blot检测PDCD4的mRNA及蛋白表达。结果ONOO-作用HCVSMCs 24 h,显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时引起PDCD4mRNA及蛋白表达显著增加。结论PDCD4基因可能在ONOO-诱导HCVSMCs凋亡的信号传导通路中起到关键作用。 展开更多
关键词 过氧亚硝酸盐 PDCD4 人脑血管平滑肌细胞 细胞凋亡
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慢病毒介导的HTRA1突变基因感染对人脑血管平滑肌细胞内氧化应激反应的影响
3
作者 石瑜 王晓玲 +2 位作者 王敏 李传芬 曹秉振 《科学技术与工程》 北大核心 2016年第9期35-39,79,共6页
检测HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,HBVSMC内氧化应激水平的变化。以HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,在特定的时间点收集NC、OE-WT HTRA1及OE-MU HTRA1三组细胞的总RNA及总蛋白,分别用RT-PCR和Western Blot... 检测HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,HBVSMC内氧化应激水平的变化。以HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,在特定的时间点收集NC、OE-WT HTRA1及OE-MU HTRA1三组细胞的总RNA及总蛋白,分别用RT-PCR和Western Blot的方法检测三组细胞的NOX4 mRNA及蛋白水平的表达情况;用DCFH-DA法检测三组细胞内的活性氧水平。从定量PCR结果可以看出,人脑血管平滑肌细胞中,OE-MU组NOX4基因表达丰度是NC组的2.015倍。从Western blot结果可以看出,在正常的人脑血管平滑肌细胞中NOX4蛋白水平表达较低,而在慢病毒LV-HRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后NOX4蛋白表达水平增高。在正常的人脑血管平滑肌细胞中ROS水平表达较低,而在慢病毒LVHRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后ROS蛋白表达水平增高,在突变型病毒感染细胞组表现更为明显。说明:1HTRA1突变型基因感染人脑血管平滑肌细胞后,细胞内活性氧产量增加,NOX4 mRNA水平的表达正常细胞升高,但较HTRA1野生型基因无明显差别;NOX4在蛋白水平表达较其他两组均升高;2HTRA1突变型基因感染的人脑血管平滑肌细胞出现增殖减少、迁移活力降低以及凋亡增加可能与细胞内的氧化应激有关,为进一步研究CARASIL发病机制奠定基础。 展开更多
关键词 HTRA1 人脑血管平滑肌细胞 活性氧 NADPH NOX4
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曲美他嗪对人脑血管平滑肌细胞增殖、迁移及活性氧表达的影响及其机制 被引量：2
4
作者 代洪媛 郭海志 李小勇 《临床内科杂志》 CAS 2020年第10期731-734,共4页
目的探讨曲美他嗪(TMZ)对人脑血管平滑肌细胞(HBVSMCs)增殖、迁移及活性氧(ROS)表达的影响及其机制。方法选用生长状况良好的对数生长期HBVSMCs分两部分进行实验,A实验:将HBVSMCs分为5组,对照组:不处理;血小板衍生生长因子(PDGF)组:加入... 目的探讨曲美他嗪(TMZ)对人脑血管平滑肌细胞(HBVSMCs)增殖、迁移及活性氧(ROS)表达的影响及其机制。方法选用生长状况良好的对数生长期HBVSMCs分两部分进行实验,A实验:将HBVSMCs分为5组,对照组:不处理;血小板衍生生长因子(PDGF)组:加入10 ng/ml PDGF;0.2μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L TMZ组:在给予PDGF基础上,分别加入终浓度为0.2μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L TMZ。B实验:将HBVSMCs分为5组,对照组:不处理;PDGF组:给予10 ng/ml PDGF;TMZ组:在给予PDGF基础上,加入浓度为5.0μmol/L TMZ;XAV939组:在给予PDGF基础上,加入浓度为2.0μmol/L XAV939;TMZ+XAV939组:在给予PDGF基础上,加入5.0μmol/L TMZ和2.0μmol/L XAV939共同处理。采用噻唑蓝法、划痕实验、二氯荧光素法分别检测各组HBVSMCs的增殖活力、迁移率及ROS表达水平,采用蛋白质免疫印迹法检测HBVSMCs中Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路相关蛋白β-catenin、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-9及原癌基因蛋白质(c-Myc)的表达水平。结果A实验中,对照组、PDGF组、0.2μmol/L TMZ组、1.0μmol/L TMZ组、5.0μmol/L TMZ组HBVSMCs的OD值、迁移率、ROS、β-catenin、Cyclin D1、MMP-9及c-Myc表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中PDGF组上述指标均高于对照组,各浓度TMZ组上述指标均低于PDGF组,且呈浓度依赖性降低(P<0.05)。B实验中,对照组、PDGF组、TMZ组、XAV939组、TMZ+XAV939组HBVSMCs的OD值、迁移率及ROS表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中PDGF组上述指标均高于对照组;TMZ组和XAV939组上述指标均低于PDGF组;TMZ+XAV939组上述指标均低于TMZ组(P<0.05)。结论TMZ可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化抑制HBVSMCs增殖、迁移及ROS表达。 展开更多
关键词 人脑血管平滑肌细胞 曲美他嗪 细胞增殖 迁移 活性氧 Wnt/β-连环蛋白信号通路
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慢病毒介导的HTRA-突变基因感染对人脑血管平滑肌细胞生物学特性影响 被引量：1
5
作者 石瑜 曹秉振 +2 位作者 王晓玲 王敏 李传芬 《中华神经医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期757-762,共6页
目的探讨HTRAJ基因及tfTRA，突变基因[1091T〉C（点突变）]慢病毒表达载体感染对人脑血管平滑肌细胞（HBVSMC）增殖、迁移及凋亡等生物学特性的影响。方法构建野生型HTRAJ基因及突变型HTRAJ基因慢病毒表达载体，并将其感染经培养和鉴定... 目的探讨HTRAJ基因及tfTRA，突变基因[1091T〉C（点突变）]慢病毒表达载体感染对人脑血管平滑肌细胞（HBVSMC）增殖、迁移及凋亡等生物学特性的影响。方法构建野生型HTRAJ基因及突变型HTRAJ基因慢病毒表达载体，并将其感染经培养和鉴定的HBVSMC，以空载体感染libVSMC为对照组。采用CCK-8法连续5d检测细胞增殖情况，Transwell实验检测细胞的迁移，流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组相比，野生型HTRAI基因慢病毒组细胞增殖无明显变化，至第3天起突变型HTRAl基因慢病毒组细胞增殖减缓，差异具有统计学意义（P〈0．05）。对照组、野生型HTRAl基因慢病毒组、突变型HTRAI基因慢病毒组细胞迁移率分别为0．474±0．079、0．612±0．037、0．283±0．064，差异有统计学意义（p〈0．05）。与对照组细胞凋亡率（3．68％±0.23％）相比，野生型HTRAI基因慢病毒组细胞凋亡率（3．13％±0．07％1降低，差异有统计学意义（P〈0．05）；突变型HTRAI基因慢病毒组细胞凋亡率（3.70％±0.20％）增多不明显，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论突变型HTRAI基因感染HBVSMC后引起该细胞增殖能力和迁移活性减弱，但对细胞凋亡无影响。 展开更多
关键词 人脑血管平滑肌细胞 HtrA丝氨酸蛋白酶1 慢病毒表达载体
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慢病毒介导的HTRA1基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立
6
作者 石瑜 王晓玲 +2 位作者 王敏 李传芬 曹秉振 《现代生物医学进展》 CAS 2016年第12期2218-2222,共5页
目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091T>C突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载... 目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091T>C突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。 展开更多
关键词 慢病毒表达载体 HTRA1 CARASIL 人脑血管平滑肌细胞
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