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人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达 被引量：7
1
作者 李昂 郑瑾 +4 位作者 来宝长 耿宜萍 王艳 王一理 司履生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期558-561,共4页
目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基... 目的　构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法　克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果　ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论　所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 L1-E6 L1-E7 人乳头瘤病毒18型 表达载体 定点突变
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人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应 被引量：4
2
作者 李昂 杨谨 +4 位作者 来宝长 耿宜萍 王艳 王一理 司履生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期760-763,共4页
目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂... 目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂 (pLXHDmB7 2或LTB)。用免疫原免疫 3次 ,末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应 (DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液 ,进行脾细胞增殖试验 ,并进行CD4 + /CD8+ T细胞中IFN γ+ 或IL 4 + 细胞的FACS分析。结果 :与对照组相比 ,各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前 ;肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结 ,镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数 (SI)和CD8+ IFN γ+ 细胞数均高于鼻内滴注组 ;而鼻内滴注组CD4 + IL 4 + 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组 ;加入pLX HDmB7 2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论 :证实了重组pVAX1 HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应。同时 ,证实B7 2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应? 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18型 DNA疫苗 免疫效应 体内
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靶向人乳头瘤病毒18E6的短发夹结构RNA慢病毒载体的构建 被引量：1
3
作者 罗远材 瞿全新 +1 位作者 糜若然 张灏 《天津医药》 CAS 北大核心 2011年第9期813-816,共4页
目的:构建含有靶向人乳头瘤病毒18型E6癌基因(HPV18E6)的短发夹结构RNA(shRNA)的慢病毒载体。方法:根据HPV18E6癌基因的相关信息,设计并合成shRNA干扰序列,连入pGCSIL-GFP质粒,构建并鉴定含有shRNA的重组质粒pGC-shRNA;将重组质粒pGC-sh... 目的:构建含有靶向人乳头瘤病毒18型E6癌基因(HPV18E6)的短发夹结构RNA(shRNA)的慢病毒载体。方法:根据HPV18E6癌基因的相关信息,设计并合成shRNA干扰序列,连入pGCSIL-GFP质粒,构建并鉴定含有shRNA的重组质粒pGC-shRNA;将重组质粒pGC-shRNA和病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,进行病毒包装,收集病毒液并进行浓缩、纯化;所得病毒液感染293T细胞,测定病毒滴度,并验证其对宫颈癌HeLa细胞HPV18E6癌基因的干扰效果。结果:HPV18E6的shRNA干扰序列与人类基因组没有同源性,此插入序列转录后得到的RNA二级结构能形成发夹状结构;重组质粒pGC-shRNA经PCR鉴定及DNA测序结果显示该重组质粒构建成功;成功对病毒进行包装、浓缩及纯化后,所得病毒滴度为3×108TU/mL,并能很好地抑制HPV18E6癌基因的表达。结论:成功构建了HPV18E6-RNAi-LV慢病毒载体,为后续RNA干扰研究的开展提供了工具。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 癌基因 RNA干扰 质粒 转染 HELA细胞 逆转录聚合酶链反应
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人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化 被引量：3
4
作者 麻粉莲 张骞 郑丽舒 《生物技术通讯》 CAS 2014年第6期800-803,共4页
目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵... 目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18型L1蛋白 包涵体 可溶性蛋白 纯化
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人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达 被引量：1
5
作者 麻粉莲 张骞 郑丽舒 《生物技术通讯》 CAS 2015年第6期763-766,共4页
目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重... 目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。 展开更多
关键词 L1蛋白 人乳头瘤病毒18型 杆状病毒 SF9细胞
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人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成
6
作者 安静 付生芳 +4 位作者 李雄雄 包红 寇桂英 白幕群 余黎 《微生物学免疫学进展》 2014年第5期11-16,共6页
目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基... 目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。 展开更多
关键词 大肠埃希菌表达系统 人乳头瘤病毒18型 L1蛋白 优化 可溶性表达 病毒样颗粒
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雌激素对宫颈癌细胞生长及人乳头瘤病毒18 E7基因表达的调节 被引量：8
7
作者 白丽霞 孙秀丽 +1 位作者 商宇红 魏丽惠 《中国妇产科临床杂志》 2004年第1期49-51,68,共4页
目的　研究雌激素 (1 7β -estradiol,E2 )对宫颈癌HeLa细胞生长的影响及细胞中人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV) 1 8E7病毒癌基因表达的调节作用。方法　用细胞计数法、流式细胞术检测不同浓度E2 对细胞生长及增殖的影响 ;用RT -... 目的　研究雌激素 (1 7β -estradiol,E2 )对宫颈癌HeLa细胞生长的影响及细胞中人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV) 1 8E7病毒癌基因表达的调节作用。方法　用细胞计数法、流式细胞术检测不同浓度E2 对细胞生长及增殖的影响 ;用RT -PCR方法半定量检测E2 对细胞中HPV1 8E7mRNA表达的影响。结果　①浓度≤ 1 0 μM时 ,E2 对HeLa细胞的生长起促进作用 ,有剂量、时间依赖性 (均P =0 0 0 0 ) ,0 5 μM的E2 作用 5d时对HeLa细胞生长的促进作用最强 ;浓度≥ 5 0 μM时 ,E2 对HeLa细胞生长有明显的抑制作用 (均P =0 0 0 0 )。②与对照组相比 ,浓度≤ 1 0 μM时 ,E2 均使HeLa细胞S期比例增加 ,当浓度为 0 5 μM时E2 使S期细胞比例增加最明显 (P =0 0 1 0 )。③ 0 5、 1 0 μM的E2 使HeLa细胞中HPV1 8E7mRNA表达明显增加 (均P =0 0 0 0 ) ;1 0 μM的E2 对细胞中HPV1 8E7mRNA表达的促进作用较 0 5 μM的E2 更强 (P =0 0 0 0 )。结论　①低浓度的E2 (≤ 1 0 μM)促进HeLa细胞生长 ,使S期细胞比例增加 ;高浓度E2 (≥ 5 0 μM)明显抑制HeLa细胞的生长。②E2 能促进HeLa细胞中HPV1 展开更多
关键词 雌激素 宫颈癌 癌细胞生长 人乳头瘤病毒18 E7 基因表达 妇科恶性肿瘤
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人乳头瘤病毒18型主要衣壳蛋白原核表达系统的构建及鉴定 被引量：5
8
作者 程险峰 穆锦江 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期845-848,共4页
目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型(HPV18)主要衣壳蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒pBR322-HPV18为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1 DNA片段,将HPV18L1 DNA与pUC 19质粒重组构建pUC19-HPV18L1重... 目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型(HPV18)主要衣壳蛋白,为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒pBR322-HPV18为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1 DNA片段,将HPV18L1 DNA与pUC 19质粒重组构建pUC19-HPV18L1重组质粒;用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化;再利用pQE32质粒做表达载体构建重组质粒pQE32-HPV18L1,并用酶切电泳验证;利用SDS-PAGE检测HPV18L1目的蛋白;利用Western杂交鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性。结果PCR扩增DNA片段约为1.7kb,与预期结果相同;克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变;表达重组质粒pQE32-HPV18L1酶切图谱亦与预期相同;SDS-PAGE显示,约63×103处可见目的蛋白带,与预期结果一致;Western杂交鉴定,在Mr约63×103处可见目的条带,与预期结果一致。结论成功构建原核表达重组质粒pQE32-HPV18L1并能表达HPV18主要衣核蛋白。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18型L1基因 基因重组 蛋白表达 鉴定
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深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建 被引量：2
9
作者 邓金桂 李体远 《广东医学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期433-436,共4页
目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制... 目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18型 E6E7基因 基因克隆 点突变 序列分析
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核不均一核糖核蛋白E1表达与人乳头瘤病毒18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的相关性 被引量：1
10
作者 宫春兰 刘国莉 +1 位作者 韩肖燕 孙晓静 《中国性科学》 2023年第4期62-66,共5页
目的检测核不均一核糖核蛋白E1(hnRNP E1)在人乳头瘤病毒(HPV)18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中表达情况,探讨其与术后复发的关系。方法选取2016年6月至2019年2月北京核工业医院收治的80例HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者的癌组织标本和80例子... 目的检测核不均一核糖核蛋白E1(hnRNP E1)在人乳头瘤病毒(HPV)18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中表达情况,探讨其与术后复发的关系。方法选取2016年6月至2019年2月北京核工业医院收治的80例HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者的癌组织标本和80例子宫良性疾病患者的正常宫颈组织标本作为研究对象,采用免疫组织化学染色法检测宫颈癌和正常宫颈组织中hnRNP E1蛋白的表达。根据宫颈癌患者术后3年内复发情况将患者分为复发组(n=15)和未复发组(n=65),分析hnRNP E1蛋白表达与HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的关系及影响HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的危险因素。结果HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中hnRNP E1蛋白表达阳性率显著低于正常宫颈组织(P<0.05);复发组宫颈癌组织中hnRNP E1蛋白表达阳性率显著低于未复发组(P<0.05);肌层浸润深度、淋巴结转移、病理类型、脉管浸润、宫旁浸润、hnRNP E1蛋白表达与HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发有关(P<0.05);有脉管浸润、有宫旁浸润、hnRNP E1蛋白阴性表达是HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者术后复发的独立危险因素(P<0.05)。结论hnRNP E1蛋白在HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中阳性表达率降低,且与宫颈癌患者术后复发有关,可作为HPV18阳性Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌患者潜在的预后标志物。 展开更多
关键词 核不均一核糖核蛋白E1 人乳头瘤病毒18阳性 Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌 术后复发
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转录因子Skn-1a激活人乳头瘤病毒18 E6基因表达的分析
11
作者 热西丹.尼格买提 李菁菁 +1 位作者 李轶杰 马正海 《新疆大学学报（自然科学版）》 CAS 2008年第3期339-342,共4页
用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理... 用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理论依据. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18型 Skn-1a 转录因子 实时定量PCR
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目视LAMP技术对人乳头瘤病毒18亚型检测的应用价值研究
12
作者 唐宏霞 熊学峰 +1 位作者 秦志强 周晓农 《中国医药科学》 2013年第18期9-10,41,共3页
目的探讨环介导等温扩增技术用于检测临床标本乳头瘤病毒HPV18亚型的应用价值。方法设计针对HPV18-L1基因序列中6个区段的4条特异引物，在等温条件下（65℃）进行核酸扩增反应1h，在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂；利用建立的环介... 目的探讨环介导等温扩增技术用于检测临床标本乳头瘤病毒HPV18亚型的应用价值。方法设计针对HPV18-L1基因序列中6个区段的4条特异引物，在等温条件下（65℃）进行核酸扩增反应1h，在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂；利用建立的环介导等温扩增方法进行敏感型检测以及检测正常体检妇女和患者子宫颈分泌物的HPV18亚型。结果LAMP检测HPV18L1基因的敏感度为1000拷贝每微升；阴道炎患者HPV18阳性检出率为5．26％（1／19）；慢性子宫颈炎组HPV18亚型检出率为10％（2／20）；宫颈上皮内瘤变（CINI～Ⅱ级）阳性检出率33．3％（3／9）；子宫颈癌I级阳性检出率为64％（16／25）。结论基于目视的环介导等温扩增方法是一种具有经济、快速筛查临床标本中HPV18亚型的诊断工具，可具有在基层医院推广应用的潜能。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 LAMP P检测 环介导等温扩增技术 亚型 阳性检出率 宫颈上皮内瘤变 慢性子宫颈炎
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女性外阴鲍恩病合并人乳头瘤病毒18阳性
13
作者 宋艳丽 陈永艳 袁伟 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期533-535,共3页
报告1例女性外阴鲍恩病合并人乳头瘤病毒18阳性。患者女,35岁。右侧会阴斑块伴瘙痒1年。皮损组织病理示:表皮角化过度伴角化不全,棘层肥厚,细胞排列紊乱,可见角化不良细胞及病理性核分裂像,基底膜完整,真皮浅层淋巴细胞浸润。人乳头瘤... 报告1例女性外阴鲍恩病合并人乳头瘤病毒18阳性。患者女,35岁。右侧会阴斑块伴瘙痒1年。皮损组织病理示:表皮角化过度伴角化不全,棘层肥厚,细胞排列紊乱,可见角化不良细胞及病理性核分裂像,基底膜完整,真皮浅层淋巴细胞浸润。人乳头瘤病毒分型检测:高危型HPV18阳性。诊断:鲍恩病。 展开更多
关键词 鲍恩病 女阴 人乳头瘤病毒18
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人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析 被引量：10
14
作者 谢明辉 李少伟 +7 位作者 沈文通 李仲艺 庄玉娣 莫小兵 顾颖 吴婷 张军 夏宁邵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期1082-1087,共6页
利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrx... 利用大肠杆菌表达系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,经过纯化和重组装过程获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),研究其免疫原性和诱发中和抗体生成的水平。首先,提取HPV18的基因组DNA,通过PCR扩增获得HPV18 L1基因片段,将其插入pTrxFus表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达HPV18 L1蛋白;其次,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析获得高纯度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除预先加入的还原剂DTT,使HPV18 L1蛋白自发组装成VLPs;最后,通过动态光散射技术和透射电子显微镜鉴定HPV18 VLPs的大小和形态,利用假病毒细胞中和实验评价HPV18 VLPs在实验动物体内的免疫原性和中和抗体生成水平。结果表明,HPV18L1蛋白可以在大肠杆菌表达系统中以可溶形式表达,经过纯化的HPV18 L1蛋白可以自发组装成为半径约为29.34nm、与HPV病毒外观相似的VLP。该VLPs在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量为0.006μg,在兔及山羊体内诱导中和抗体滴度高达107。总之,本研究利用原核表达系统可简便高效地获得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,为HPV18预防性疫苗的开发奠定了基础,具有重要的应用意义。 展开更多
关键词 大肠杆菌表达系统 人乳头瘤病毒18型 病毒样颗粒 免疫原性 中和抗体
原文传递
细胞角蛋白19联合人乳头状瘤病毒DNA(16/18型)检测早期宫颈癌淋巴结微转移 被引量：4
15
作者 柴凤霞 樊玉兰 窦心灵 《国际检验医学杂志》 CAS 2010年第12期1394-1395,1397,共3页
目的探讨早期宫颈癌患者淋巴结中细胞角蛋白19(CK-19)mRNA和人乳头状瘤病毒(HPV)DNA(16/18型)的表达及联合检测的临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,检测CK-19mRNA和HPVDNA(16/18... 目的探讨早期宫颈癌患者淋巴结中细胞角蛋白19(CK-19)mRNA和人乳头状瘤病毒(HPV)DNA(16/18型)的表达及联合检测的临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,检测CK-19mRNA和HPVDNA(16/18型)在30例早期宫颈癌患者194枚淋巴结中的阳性率及二者联合检测的敏感度和准确度。结果 30例早期宫颈癌患者的淋巴结194枚,常规病理学HE染色检出8例患者26枚淋巴结转移、22例患者无转移淋巴结164枚。在22例HE染色未检出淋巴结转移组中,聚合酶链反应检测9例患者40枚淋巴结CK-19mRNA呈阳性,12例患者68枚淋巴结HPVDNA(16/18型)呈阳性。转移淋巴结组和无转移淋巴结组CK-19mRNA阳性率分别为92.3和23.8,HPVDNA(16/18型)阳性率分别为96.2和40.5;比较两组淋巴结CK-19mRNA和HPVDNA(16/18型)阳性检出率,转移淋巴结组明显高于无转移淋巴结组(P<0.01)。单独检测CK-19mRNA敏感度为33.0,HPVDNA敏感度为47.9;采用二者联合检测,敏感度可达76.8,准确度为81.8。结论 CK-19mRNA和HPVDNA(16/18型)可作为判断早期宫颈癌淋巴结微转移的参考指标,二者联合检测有较高的检出率。 展开更多
关键词 角蛋白质类 人乳头瘤病毒16 人乳头瘤病毒18 DNA 宫颈肿瘤 淋巴结 肿瘤转移 mRNA信使
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人乳头瘤病毒18型E7基因和次级淋巴组织趋化因子基因疫苗的制备 被引量：1
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作者 曾凡慧 朱平 +2 位作者 张昌菊 雷小敏 柳长柏 《中国新药与临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期856-859,共4页
目的以减毒的鼠伤寒沙门菌为载体,制备人乳头瘤病毒(HPV)18型E7基因与次级淋巴组织趋化因子(SLC)基因疫苗。方法PCR方法扩增HPV 18 E7和SLC基因片段,将其连接至pcDNA3.1(-)载体中,构建重组质粒pcDNA3.1(-)-HPV 18 E7和pcDNA3.1(-)-SLC... 目的以减毒的鼠伤寒沙门菌为载体,制备人乳头瘤病毒(HPV)18型E7基因与次级淋巴组织趋化因子(SLC)基因疫苗。方法PCR方法扩增HPV 18 E7和SLC基因片段,将其连接至pcDNA3.1(-)载体中,构建重组质粒pcDNA3.1(-)-HPV 18 E7和pcDNA3.1(-)-SLC。酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染至小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16F10中,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因和蛋白的表达。重组质粒电转化导入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,酶切鉴定重组质粒的正确导入。结果pcDNA3.1(-)-HPV 18 E7和pcDNA3.1(-)-SLC经相应酶切及测序证实其大小和序列与理论结果一致。HPV 18 E7和SLC在B16F10细胞中正确表达,RT-PCR和Western blotting所得结果及导入沙门菌SL3261的重组质粒酶切所得片段大小均在理论值范围内。结论成功制备以沙门菌SL3261为载体的HPV 18 E7和SLC基因疫苗。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 趋化因子 CC 疫苗 DNA
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人乳头瘤病毒16/18阳性联合阴道镜检查在宫颈细胞学阴性宫颈病变诊断中的应用 被引量：8
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作者 宋文榕 崔焱 潘琳 《山西医药杂志》 CAS 2023年第4期265-269,共5页
目的观察人乳头瘤病毒(HPV)16/18阳性联合阴道镜检查在宫颈细胞学阴性的宫颈病变诊断中的应用。方法选取我院妇科门诊2018年6月至2021年6月收治的宫颈细胞学检测结果为阴性且HPV 16/18阳性结果的患者120例,所有患者均接受阴道镜检查及... 目的观察人乳头瘤病毒(HPV)16/18阳性联合阴道镜检查在宫颈细胞学阴性的宫颈病变诊断中的应用。方法选取我院妇科门诊2018年6月至2021年6月收治的宫颈细胞学检测结果为阴性且HPV 16/18阳性结果的患者120例,所有患者均接受阴道镜检查及宫颈活检联合宫颈管搔刮术(ECC),以病理学诊断为标准,分析诊断效果。结果组织病理学结果显示,120例患者中宫颈炎85例(70.8%),宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ15例(12.5%),CINⅡ13例(10.8%),CINⅢ5例(4.2%),宫颈癌2例(1.7%)。120例宫颈细胞学检测结果为阴性且HPV 16/18阳性的患者中,HPV 16型感染90例(75.0%),HPV18型感染20例(16.7%),HPV16/18型同时阳性感染10例(8.3%)。90例HPV 16阳性患者中,宫颈炎72例,CIN 8例,CINⅡ6例,CINⅢ3例,宫颈癌1例;20例HPV 18阳性患者中,宫颈炎10例,CINⅠ5例,CINⅡ4例,CINⅢ1例,宫颈癌0例;10例HPV 16/18同时阳性患者中,宫颈炎3例,CINⅠ2例,CINⅡ3例,CINⅢ1例,宫颈癌1例。HPV 16/18 HPV同时阳性患者≥CINⅡ级比例为50.0%,高于HPV16/18单一阳性患者的11.1%和25.0%,差异具有统计学意义(P<0.05)。阴道镜诊断宫颈细胞学阴性、HPV 16/18阳性患者的宫颈病变准确率为95.0%,灵敏度为96.0%,特异度为85.5%。结论对于宫颈细胞学阴性、HPV 16/18阳性患者宜进一步行阴道镜宫颈活检,以减少宫颈高级别鳞状CIN甚至癌变的漏诊。 展开更多
关键词 宫颈疾病 技术细胞学 人乳头瘤病毒16 人乳头瘤病毒18 阴道镜检查
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宁波市奉化区女陛宫颈人乳头瘤病毒18型感染流行变异谱系分析 被引量：1
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作者 张姝 许国章 +1 位作者 倪红霞 李永东 《国际流行病学传染病学杂志》 CAS 2018年第6期401-404,共4页
目的了解宁波市奉化地区妇女感染HPV高危亚型18相关基因E6、E7区基因变异谱系特征。方法采用整群随机抽样方法,收集宁波市奉化区778例妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV18阳性株进行癌相关基因E6、E7区测序和序列分析... 目的了解宁波市奉化地区妇女感染HPV高危亚型18相关基因E6、E7区基因变异谱系特征。方法采用整群随机抽样方法,收集宁波市奉化区778例妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV18阳性株进行癌相关基因E6、E7区测序和序列分析。结果HPV18检出率为1.3%(10/778),HPV18病毒株E6、E7基因序列分别成功获得11和10条,E6区有1个位点发生碱基颠换(C287G),E7区未发现突变;系统进化树分析显示,奉化地区HPV18变异株主要位于该亚型基因变异谱系A的A1亚系。结论宁波市奉化地区妇女HPV18感染率较低,HPV18病毒株癌相关基因变异较小。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 E6 E7 基因 变异
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含编码人乳头瘤病毒18型L1蛋白基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的条件优化 被引量：1
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作者 丁军颖 张振龙 +4 位作者 孙丽媛 刘君 张夕燕 于世荣 许雪梅 《国际生物制品学杂志》 CAS 2009年第2期68-70,共3页
目的确定以昆虫细胞sf9F增含编码人乳头瘤病毒（human papillomavims，HPV）18型L1蛋白（HPV18L1）基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件。方法以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数（M01）和不同时间条件下扩增病毒，以蚀斑试验... 目的确定以昆虫细胞sf9F增含编码人乳头瘤病毒（human papillomavims，HPV）18型L1蛋白（HPV18L1）基因的杆状病毒以及相应蛋白表达的最佳条件。方法以对数生长期的sf9细胞在不同感染复数（M01）和不同时间条件下扩增病毒，以蚀斑试验检测病毒滴度，选择获得最高滴度病毒的最佳条件；再以sf9细胞在不同细胞密度、不同MOI值和不同时间条件下表达相应蛋白，以蛋白印迹法鉴定并比较不同条件下的蛋白表达量，选择获得最大量目的蛋白的最佳条件。结果对数生长期的sf9细胞在MOI值为0．50、扩增时间为48h时，所扩增的病毒滴度最高，可达3×10^8pfu／ml；在细胞密度为3×10^6／ml、MOI值为2．0、表达时间为72h时，所表达的蛋白量最大，约5mg/L。结论确定了含编码HPV18L1基因的杆状病毒扩增及相应蛋白表达的最佳条件。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒18 L1基因 杆状病毒 昆虫细胞 病毒样颗粒
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JY佐剂对人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒黏膜免疫效果的影响
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作者 麻粉莲 袁武梅 +3 位作者 张骞 郑文芝 赵智慧 郑丽舒 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第5期585-589,共5页
目的探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白病毒样颗粒(Virus-like parti-cle,VLP)黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。方法用含或不含JY佐剂的HPV18 L1 VLP分别经肌肉... 目的探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白病毒样颗粒(Virus-like parti-cle,VLP)黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。方法用含或不含JY佐剂的HPV18 L1 VLP分别经肌肉和鼻腔免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,ELISA法检测血清IgG抗体滴度;于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,采用IFNγELISPOT试剂盒检测细胞免疫效果,ELISA法检测黏膜免疫效果;鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,每次间隔3周,收集第14、20、26、32和38周的血清,ELISA法检测HPV18 L1蛋白与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。结果免疫3次后,不含或含有佐剂的HPV18 L1蛋白经肌肉免疫后的血清IgG抗体滴度(均为104.6)高于经鼻腔免疫后的血清IgG抗体滴度(分别为101.9和102.8)。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后呼吸道灌洗液中sIgA抗体浓度(30.06μg/ml)明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(23.47μg/ml)(P<0.01),但肌肉免疫组未检测到sIgA抗体。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫诱导的细胞斑点数明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(P<0.01),不含佐剂与含佐剂的HPV18 L1蛋白肌肉免疫组诱导的细胞斑点数差异无统计学意义(P>0.05)。HPV18 L1免疫小鼠后的血清与HPV58、11和6型之间均有交叉反应,在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。结论 HPV18 L1 VLP经肌肉免疫后,其血清抗体水平高于鼻腔免疫组,但该蛋白鼻腔免疫后细胞免疫反应和黏膜sIgA抗体水平均高于肌肉免疫组;JY佐剂能增强HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后的小鼠细胞反应及黏膜sIgA抗体应答,但肌肉免疫组佐剂作用不明显;HPV18 L1蛋白反复鼻腔免疫后,可拓宽抗原保护谱。 展开更多
关键词 JY佐剂 人乳头瘤病毒18 L1蛋白 病毒样颗粒 黏膜免疫
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