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非洲猪瘟病毒p30蛋白在乳酸菌工程菌株中的表达及动物免疫
1
作者 陈萌萌 赵洪哲 +7 位作者 刘春羽 陈克伟 王亚新 孟海 王昊 张赫 温永俊 王凤雪 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期1-8,共8页
为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸... 为了探究表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的重组乳酸杆菌口服免疫防控非洲猪瘟效果,以载体pPG612.1为骨架,构建重组质粒,将其电转到乳酸菌XM-38感受态细胞中,抗性筛选获得含有pPG612.1-p30表达质粒的重组乳酸菌,木糖诱导其表达,通过Western blot和间接免疫荧光,鉴定融合表达蛋白的免疫反应性及膜表达定位;进一步用重组菌灌喂ASFV抗体阴性的健康仔猪,采集猪血清进行ELISA和Western blot检测p30抗体。结果表明,成功构建了融合表达ASFV p30蛋白的乳酸杆菌,命名为XM38-pPG612.1-p30;重组表达蛋白分子质量约59 ku,与p30单抗有良好结合活性;表达的ASFV p30能锚定在乳酸菌XM-38细胞表面;动物免疫试验表明重组菌XM38-pPG612.1-p30可刺激猪产生抗ASFV p30的抗体,为ASFV新型疫苗的研发提供了思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 p30蛋白 免疫原性 乳酸菌 细胞共定位
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非洲猪瘟病毒p30蛋白与CRM197的融合表达及对小鼠的免疫原性评价
2
作者 张琦 董宁宁 +9 位作者 谈晓梅 石正旺 李娜 朱雯琪 汤傲星 李传锋 朱杰 刘光清 苏艳 孟春春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5230-5237,共8页
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。... 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的无毒突变体CRM197已被成功地用作多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋白,以增强多糖的免疫原性。本研究构建p30与CRM197催化结构域(A片段)的融合表达质粒,纯化后的重组蛋白和单独p30分别使用小鼠评价了其免疫原性。结果显示:通过原核表达与亲和层析纯化得到融合蛋白p30-CRM197(A)免疫小鼠后,较单独表达的p30其可以在更短的时间内激发起高水平针对p30的特异性IgG,并且在初次免疫后56 d后还能维持较高水平的淋巴细胞免疫活力。本研究结果表明,CRM197的A片段作为载体蛋白显著增强原核表达p30蛋白的免疫原性,其可作为非洲猪瘟亚单位疫苗的候选分子内佐剂。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 CRM197 p30 免疫原性
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非洲猪瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表达及反应原性分析
3
作者 周俊明 倪艳秀 +5 位作者 范宝超 祝昊丹 朱雪蛟 王丹丹 胡屹屹 李彬 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第10期1875-1881,共7页
为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,... 为比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反应原性,探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原优势片段。本研究通过PCR、克隆技术将p30蛋白氨基酸序列中不同片段的编码基因分别插入表达质粒pET32a,经IPTG诱导、Ni柱纯化、透析后,获得p30蛋白氨基酸序列中8~101 aa片段(P-1#)、58~101 aa片段(P-2#)、101~158 aa片段(P-3#)、8~194 aa片段(P-4#),用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段与p30蛋白免疫兔血清和ASFV阳性猪血清的反应原性。结果显示,上述片段均获得诱导表达及纯化,表达形式有可溶性表达(P-1#、P-3#)和包涵体表达(P-2#、P-4#)。各片段以1.0 mg/L包被时,p30免疫兔血清与p30蛋白氨基酸序列中4种片段均能发生免疫反应,ASFV阳性猪血清与P-4#、P-1#反应较佳,与P-3#反应中等,与P-2#反应最弱。综上,p30蛋白氨基酸序列中不同片段反应原性的差异为认识p30抗原优势区域提供了数据,这将有助于非洲猪瘟血清学诊断抗原的科学筛选。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 氨基酸序列片段 反应原性
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非洲猪瘟病毒p30生物信息学分析及多克隆抗体的制备
4
作者 陈春龙 张丽荣 孔令保 《生物灾害科学》 2024年第4期524-535,共12页
【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重... 【目的】目前国内流行的变异非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)表现出毒力低,传染性强,隐蔽性强的特点,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)临床表现不明显,早期诊断难度大,快速灵敏的早期诊断试剂盒对于非洲猪瘟防控至关重要,而p30的研究及其多克隆抗体的制备可以为早期诊断试剂盒的开发提供重要的理论依据。【方法】根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离的非洲猪瘟毒株Pig/Heilongjiang/HRB1/2020(GenBank:MW656282)提供的p30的氨基酸序列,利用生物信息学软件对该序列的理化性质,亲/疏水性,跨膜区,信号肽及二三级结构进行分析预测,由生物公司优化密码子并合成重组质粒pET-28a-p30。将p30克隆到pET-32a(+)原核表达载体中,将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,对异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行优化,用纯化所得的p30蛋白对小鼠进行3次免疫,获取多克隆抗体并检测效价。【结果】由生物信息学分析结果得出p30蛋白含194个氨基酸,分子式为C_(1001)H_(1575)N_(259)O_(308)S_(7),p30蛋白为亲水性蛋白,不含跨膜区,无信号肽,二三级结构中含大量的α-螺旋。蛋白表达结果显示,当诱导时间为6 h,IPTG终浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为34℃时,p30重组蛋白表达量达到最佳,浓度高达0.9 mg/mL以上,1 L菌液可产53 mg重组蛋白。通过间接ELISA测得小鼠血清抗体效价高达1:10000000。Western Blotting结果显示,制备的p30蛋白具有较好的特异性。【结论】经过表达优化p30蛋白产量得到明显提高,并获得效价较高的多克隆抗体,且具有很好的特异性。对研发针对p30更加灵敏的诊断试剂盒提供了重要的理论依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 生物信息学分析 原核表达 多克隆抗体
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肺炎支原体黏附蛋白P30研究进展
5
作者 张汝 左颖颖 +1 位作者 李水红 雷爱华 《中南医学科学杂志》 CAS 2024年第3期488-491,共4页
肺炎支原体(Mp)是导致儿童、青少年及老年人上、下呼吸道感染的主要病原体,可导致肺炎、肺内外并发症及呼吸系统后遗症等。Mp黏附蛋白P30与P1蛋白一样在感染宿主细胞中发挥重要作用。本文从P30蛋白的结构和亚型、功能、血清学诊断及疫... 肺炎支原体(Mp)是导致儿童、青少年及老年人上、下呼吸道感染的主要病原体,可导致肺炎、肺内外并发症及呼吸系统后遗症等。Mp黏附蛋白P30与P1蛋白一样在感染宿主细胞中发挥重要作用。本文从P30蛋白的结构和亚型、功能、血清学诊断及疫苗开发等方面介绍P30蛋白的最新研究进展,为Mp感染的诊断及防治研究提供参考。 展开更多
关键词 肺炎支原体 黏附蛋白p30 功能 诊断 疫苗
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在293T细胞中的瞬时表达
6
作者 刘郁夫 林晓慧 +3 位作者 黎洁泳 官逸瑶 刘俐 冯美莹 《肇庆学院学报》 2024年第5期84-89,共6页
为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以wester... 为真核表达非洲猪瘟病毒p30蛋白,探究其对炎症反应相关基因表达的影响.实验根据NCBI上的p30基因序列合成基因,将其克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,再将重组质粒转染到293T细胞中,培养24 h后通过荧光显微镜观察质粒的转染情况,以western blots试验检测目的蛋白的表达情况,最后再利用RTqPCR检测过表达p30蛋白的293T细胞中NF-κB信号通路和炎症反应相关基因的mRNA转录情况.结果显示,293T细胞转染重组质粒24 h后,约80%的细胞可显示绿色荧光,并且western blots检测到一条可与Flag标签抗体特异性反应的条带,大小与预期相符.RT-qPCR试验表明,过表达ASFV p30蛋白的293T细胞中,炎性反应相关细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平得到显著上调,上调倍数为对照组的2.988~3.605倍.试验可为ASFV抗原抗体检测技术的研发提供前期基础,为ASFV分子致病机制研究提供参考. 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30 293T细胞 炎性细胞因子
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刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文) 被引量：9
7
作者 张佃波 魏庆宽 +7 位作者 宰德富 崔勇 李瑾 高红刚 柏雪莲 赵立江 韩广东 刘克义 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期538-543,共6页
目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PC... 目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 p30和ROP2基因 融合蛋白 WESTERN blot.
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弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果 被引量：14
8
作者 龚娅 陈晓光 冯明钊 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期282-286,共5页
目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜... 目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 核酸免疫 重组质粒 免疫效果
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弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠的细胞免疫反应及抗体生成的动态过程 被引量：8
9
作者 李文姝 陆惠民 +2 位作者 张惠琴 夏超明 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第2期82-84,共3页
目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELIS... 目的　观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫效果和抗体IgG的动态发生过程。方法　口服免疫BALB/c小鼠 ,一个月后 ,取鼠脾细胞作ConA刺激淋转试验 (MTT法 )及T细胞亚群的测定 ;不同免疫时间段内 ,收集实验鼠血清 ,ELISA法检测抗体水平的变化。结果　P30乳酸球菌口服免疫组脾淋巴细胞ConA刺激后增殖能力比两对照组显著提高 ,CD+ 4 和CD+ 8的百分数均明显升高 ;第 12周 (即最后一次免疫结束一个月 ) ,P30乳酸球菌口服免疫组检测到特异性抗体IgG。结论　P30乳酸球菌口服疫苗有效地激发了小鼠细胞免疫反应 ,特异性抗体IgG在免疫结束一个月后生成明显。 展开更多
关键词 弓形虫 p30乳酸球菌口服疫苗 诱导 小鼠 细胞免疫反应 抗体生成 动态过程
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弓形虫表面抗原P22、P30复合基因在原核细胞中表达的研究 被引量：7
10
作者 古钦民 王伟 +4 位作者 卞继峰 丛华 胡海燕 何深一 李瑛 《山东大学学报（医学版）》 CAS 2002年第2期123-124,127,共3页
目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳... 目的 :对含有P2 2、P30复合基因的重组菌进行IPTG诱导表达 ,进而检测复合基因的融合表达产物的免疫活性。方法 :用IPTG对工程菌进行诱导表达 ,表达产物行SDS PAGE蛋白凝胶电泳及Western Blot免疫印记检测。结果 :蛋白电泳结果显示 ,阳性重组菌比阴性菌在 6 6 .5KDa位置上明显多一条带 ,此条带可与P30抗体结合并使免疫印记显示阳性结果。结论 :含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体经诱导表达出融合蛋白 ,其内的组分蛋白P30具有与其相应抗体结合的能力。 展开更多
关键词 弓形虫 基因 p30 基因 P22 基因表达
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弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导的细胞免疫应答 被引量：16
11
作者 周永安 陈观今 +2 位作者 郭虹 郑焕钦 吕芳丽 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第3期11-13,共3页
目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定... 目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠，观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30，经肌肉注射BALB／c小鼠，每隔3周接种1次，一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定，采用免疫荧光法对CD4+、CD8+细胞进行测定。结果实验组NK细胞杀伤率为：70．0％±3．64，对照组及空白对照组分别为48．5％±6．06和470％±5．93，实验组NK细胞活性比对照组明显增高（P＜0．05）；ConA刺激小鼠淋巴细胞转化实验，实验组与对照组及空白对用级差异无显著性（P＞0．05）;对T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋进行动态分析，可见随着感染时间的延长，CD8＋的数量逐渐上升，CD4＋／CD8＋的比率逐渐下降，实验组与对照组及空白对照有明显差异（P＜0．05）。结论重组质粒pcDNA3-p30免疫BALB／c小鼠可诱导一定的细胞免疫。 展开更多
关键词 弓形虫 DNA疫苗 p30基因 细胞免疫应答
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弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达 被引量：12
12
作者 杨秋林 陆惠民 +1 位作者 闵太善 黄伟达 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第4期27-29,共3页
目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ... 目的　在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并以SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。 结果　 1、在我们比较的 783个碱基中 ,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同 ;2、得到一分子量为 5 4kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 38%。结论　 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异 ;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。 展开更多
关键词 弓形虫 p30 PCR 基因表达 克隆
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非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备 被引量：7
13
作者 李杰 张星星 +6 位作者 郭晶 孟庆玲 乔军 张国武 王晓婷 李妍 才学鹏 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第9期126-130,共5页
为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片... 为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p30-54融合蛋白 大肠杆菌表达系统 多克隆抗体 反应原性
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绵羊肺炎支原体P30-HSP70C融合蛋白的表达及免疫原性研究 被引量：5
14
作者 刘文青 胡明丽 +1 位作者 孙红岩 赵宝华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期894-897,共4页
为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30... 为增强绵羊肺炎支原体标准株Y98的外膜抗原P30的免疫原性,本研究构建p30-hsp70C融合基因的原核重组表达载体,并转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和western blot结果表明,P30-HSP70C融合蛋白约40%以可溶性形式表达。将r P30和r P30-HSP70C以100μg/只剂量分别免疫小鼠,免疫两次。间接ELISA试验表明,免疫的小鼠血清中两种蛋白的抗体效价分别为1∶8 000和1∶128 000。此外,两种蛋白免疫的小鼠血清中均检测出特异性的P30抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,r P30和r P30-HSP70C的免疫保护率分别为50%和80%。这些结果表明P30和HSP70C的融合表达可以显著增强P30蛋白的免疫保护效果。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 p30 HSP70C 克隆 表达 免疫原性
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截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索 被引量：13
15
作者 龚娅 陈晓光 杨培梁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2001年第2期14-18,共5页
目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (P30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍 ,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,插入载体pET ... 目的　构建能在E .coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原 (P30 )基因的重组表达质粒 ,并对纯化条件进行优化。方法　对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍 ,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,插入载体pET 30 (a)中 ,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达 ,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后 ,进行SDS PAGE及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段 ,成功构建重组表达质粒 pET P30 ;SDS -PAGE显示蛋白表达带的分子量约为 31kD ,表达量占菌体总蛋白的 31.5 8% ,经 1M及 2M尿素洗涤后 ,其纯度分别达 6 3.42 %及 75 .74% ;免疫印迹显示 ,该纯化蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别 ,而且当浓缩至初始体积的 1/ 3～ 1/ 6时 ,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论　成功构建重组质粒 pET P30 ,并以融合蛋白的形式进行了高效表达 ,经变性、复性后 ,该蛋白具有特异的免疫反应性 ,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。 展开更多
关键词 弓形虫 p30基因 蛋白表达 E.COLI 纯化
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弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究 被引量：7
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作者 周永安 陈观今 +1 位作者 郭虹 郑焕钦 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1999年第5期41-43,共3页
目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠， 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ， 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度；... 目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠， 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ， 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度； 免疫鼠血液组织 Ｐ３０ 基因 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增； 弓形虫攻击感染。结果　用 Ｅ Ｌ Ｉ Ａ Ｓ 法检测的抗体 Ｉｇ Ｇ 滴度１∶２５６０ ， 免疫后３ 周及６ 个月从免疫鼠血液组织中检测到 Ｐ３０ 基因；攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（ Ｐ＜ ００５） ， 结论　重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠可诱导一定的体液免疫应答， 对抗攻击感染具有一定的保护性。 展开更多
关键词 DNA 弓形体病 p30基因 免疫应答 小鼠
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弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-2及NO含量的测定 被引量：5
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作者 李文姝 陆惠民 +1 位作者 张惠琴 黄伟达 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2006年第5期356-358,共3页
目的观察弓形虫P30乳酸球菌(L.lactis/P30)口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γI、L-2及NO的变化情况。方法L.lactis/P30口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清,ELISA法... 目的观察弓形虫P30乳酸球菌(L.lactis/P30)口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γI、L-2及NO的变化情况。方法L.lactis/P30口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清,ELISA法测定血清IFN-γI、L-2含量;酶法测定NO浓度。结果L.lactis/P30口服免疫鼠血清中IFN-γI、L-2含量均显著高于两对照组,血清中NO含量随着免疫时间延长与两对照组差异逐渐明显。结论L.lactis/P30口服免疫能有效刺激小鼠细胞因子IFN-γ和IL-2的产生及NO分子的释放。 展开更多
关键词 弓形虫 p30乳酸球菌 口服免疫 细胞因子 NO
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非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：30
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作者 吴竞 王西西 +2 位作者 吴映彤 任肖 郭晓宇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第12期3555-3562,共8页
为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经... 为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟(ASFV) p30基因 原核表达 重组蛋白 间接ELISA
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弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定 被引量：10
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作者 高红刚 张佃波 +1 位作者 卞传秀 刘克义 《中国热带医学》 CAS 2007年第4期489-491,503,共4页
目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳... 目的构建和鉴定弓形虫P30-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M.S载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSTM3,构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2,电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中,潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子,温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体,SDS-PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表达蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗,为弓形虫病的防治提供了一种新方法。 展开更多
关键词 弓形虫 p30-ROP2复合基因 耻垢分枝杆菌M.S 穿梭表达载体
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弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析 被引量：3
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作者 李越希 张锦海 +1 位作者 陶开华 黄培堂 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期674-679,共6页
利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白 ,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列 ,通过计算机分析 ,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段... 利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白 ,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列 ,通过计算机分析 ,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET2 8a(+)内 ,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白 ,用已知的 6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清 ,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌 ,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 2 5 %。纯化获得了表达的融合蛋白 ,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体 ,用于临床及孕妇检测 ,对优生优育有较大意义。 展开更多
关键词 弓形虫 GRA6 p30 融合蛋白 基因表达
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