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PCR诊断牛新孢子虫病的初步应用 被引量：5
1
作者 王春仁 翟延庆 +4 位作者 赵兴存 谭秋菊 陈佳 陈爱华 王宇 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期140-143,共4页
目的以犬新孢子虫Nc-5基因为目的基因的PCR诊断方法,检测奶牛流产的胎牛脑组织的新孢子虫。方法根据GenBank发布的新孢子虫特异性基因片段Nc-5基因序列,设计1对特异性引物,以犬新孢子虫(Neospora caninum)标准株DNA为模板,PCR扩增Nc-5基... 目的以犬新孢子虫Nc-5基因为目的基因的PCR诊断方法,检测奶牛流产的胎牛脑组织的新孢子虫。方法根据GenBank发布的新孢子虫特异性基因片段Nc-5基因序列,设计1对特异性引物,以犬新孢子虫(Neospora caninum)标准株DNA为模板,PCR扩增Nc-5基因,与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌JM109,获得阳性重组质粒pMD18-T-Nc-5,并测序。以环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫以及犬新孢子虫标准株DNA为模板进行扩增以验证PCR的特异性,采用紫外分光光度计测定犬新孢子虫标准株DNA浓度和纯度,取高纯度的DNA样品用灭菌水稀释,分别取不同量的DNA进行PCR扩增,确定PCR方法的敏感性;利用该方法对32份奶牛流产的胎牛脑组织样品进行检测,同时,对其中23份流产的母牛血样进行ELISA血清学检测(作为对照),以评价犬新孢子虫PCR方法的检测效果。结果克隆的犬新孢子虫标准株目的基因大小为350bp,与GenBank(AY459289)中Nc-5基因序列一致性为98%,建立的犬新孢子虫PCR方法与环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫均无交叉反应,最低能检测犬新孢子虫DNA3.125pg,检测流产胎牛脑组织阳性率为18.8%(6/32)。ELISA检验流产母牛血样抗体阳性率为17.4%(4/23),这4份阳性样品与其流产胎牛PCR检测结果均为阳性。结论建立的犬新孢子虫PCR诊断方法用于检测奶牛流产的胎牛脑组织新孢子虫的感染效果较好。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 nc-5基因 PCR扩增 胎牛
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新孢子虫荧光PCR检测方法的研究 被引量：4
2
作者 员丽娟 史茜 +1 位作者 季新成 牛国辉 《中国动物检疫》 CAS 2012年第8期40-42,共3页
根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计荧光定量PCR引物和荧光探针,经反应条件的优化,建立了检测新孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。通过对系列稀释的重组质粒进行重复性检测,Ct值的变... 根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计荧光定量PCR引物和荧光探针,经反应条件的优化,建立了检测新孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。通过对系列稀释的重组质粒进行重复性检测,Ct值的变异系数为0.50%~1.18%。应用该方法对50份牛全血和8份流产胎儿样本进行检测,有5份全血和1份流产胎儿样本为阳性,阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7%）高。且具有较好的特异性和可重复性,可用来对新孢子虫病快速准确检测。 展开更多
关键词 新孢子虫 nc-5基因 荧光PCR
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