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PROC基因N355S、G392E、T314A突变致蛋白C缺陷的分子机制研究
1
作者 李天逸 江淼 +4 位作者 黄璐璐 韩晶晶 马珍妮 白霞 夏利军 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1834-1840,共7页
目的:研究人蛋白C基因(PROC)N355S、G392E、T314A点突变致蛋白C(PC)功能缺陷的分子机制。方法:构建PROC基因野生型和突变型质粒(PCWT、PCN355S、PCG392E、PCT314A)并瞬时转染至HEK293细胞,进行突变蛋白的体外表达试验,用实时荧光PCR检... 目的:研究人蛋白C基因(PROC)N355S、G392E、T314A点突变致蛋白C(PC)功能缺陷的分子机制。方法:构建PROC基因野生型和突变型质粒(PCWT、PCN355S、PCG392E、PCT314A)并瞬时转染至HEK293细胞,进行突变蛋白的体外表达试验,用实时荧光PCR检测野生型和突变型PC转染24 h后的mRNA水平变化。Western blot和ELISA分别检测野生型及突变PC细胞内外蛋白水平变化。将转染24-48 h的细胞上清液进行超滤浓缩,对浓缩液中的蛋白进行定量,并进行PC的激活和酶动力学试验。Clustal Omega多序列比对分析氨基酸突变位点的保守性。利用PyMOL软件分析突变对PC蛋白质结构造成的影响。结果:PCN355S、PCG392E、PCT314A组PROC mRNA相对表达量分别为1.14±0.46、0.96±0.08和1.08±0.17,与PCWT组的1.02±0.24相比均无显著差异(P>0.05)。转染细胞裂解物的Western blot分析结果显示,PCT314A重组蛋白的含量略降低,条带相对较浅。浓缩细胞培养上清液的ELISA结果显示,PCN355S、PCG392E的PC:Ag水平分别为98.8%±2.4%、101.4%±3.1%,与PCWT相比无明显差异,而PCT314A的PC:Ag水平(88.6%±3.2%)则较PCWT有所下降(P<0.05)。酶动力学试验的结果表明,APCN355S(Km=338.3±43.2,V_(max)=2.015±0.12)、APCG392E(Km=292.2±28.4,V_(max)=1.893±0.07)和APCT314A(Km=299.5±24.6,V_(max)=1.775±0.06)与APCWT(Km=238.2±4.58,Vmax=3.205±0.06)相比,均表现为Km值的升高和Vmax的下降。多序列比对提示,3种突变在不同物种中均具有高度保守性。结构模型提示,N355S、G392E、T314A突变的氨基酸替换与周围的氨基酸基团产生碰撞,使周围的结构产生扭曲,对PC的折叠和发挥生物学功能产生不利影响。结论:PROC基因的N355S、G392E和T314A突变通过减弱PC与底物间的结合导致PC的功能缺陷。这3种突变在蛋白结构上产生了严重的空间碰撞,影响了PC的折叠和活性位点的反应性。 展开更多
关键词 蛋白C 蛋白C缺陷 基因突变 结构分析
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血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)单克隆抗体的鉴定以及生物学功能的研究 被引量：3
2
作者 马珍妮 凌婧 +4 位作者 沈飞 谢丽倩 殷杰 苏健 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期1104-1109,共6页
目的:构建并鉴定血管血友病因子裂解酶(ADAMTS13)单克隆抗体,并研究其生物学功能。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截断型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠,经标准单克隆抗体技术制备单克隆抗体。用ELISA方法鉴定单... 目的:构建并鉴定血管血友病因子裂解酶(ADAMTS13)单克隆抗体,并研究其生物学功能。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截断型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠,经标准单克隆抗体技术制备单克隆抗体。用ELISA方法鉴定单克隆抗体的特异性;应用免疫印迹技术确定单克隆抗体与全长ADAMTS13的识别能力;观察单克隆抗体对ADAMTS13水解v WF的影响。结果:最终获得6株抗ADAMTS13的单克隆抗体,克隆号分别为1G11、2F11、6G3、9E1、10A8、10B4。经ELISA鉴定,纯化后的单克隆抗体1G11和2F11的效价最高,与截断型ADAMTS13-T7蛋白结合能力比较,明显高于全长ADAMTS13蛋白。Western blotting结果显示,6个单克隆抗体都能与全长ADAMTS13结合,其中1G11和2F11条带最亮。功能实验表明,在变性条件下1G11和2F11能够明显抑制ADAMTS13水解v WF,并随着单克隆抗体浓度的增加而抑制作用增强。结论:成功获得针对ADAMTS13的单克隆抗体,其中两株为抑制性功能抗体。 展开更多
关键词 血管性血友病因子裂解蛋白酶 血管性血友病因子 单克隆抗体
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Spacer区蛋白对ADAMTS13活性影响的研究 被引量：2
3
作者 马珍妮 凌婧 +4 位作者 殷杰 沈飞 苏健 谢丽倩 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1596-1601,共6页
目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,... 目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,收集超声上清并鉴定。并大规模诱导表达,利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化产品纯度和免疫学活性。利用重组蛋白与免疫性调节的血栓性血小板减少性紫癜(iTTP)患者血浆孵育,检测血浆中ADAMTS13的活性变化。结果:成功构建能表达spacer区的原核表达质粒并能有效表达蛋白。Western blotting结果显示,抗6×His抗体和抗人ADAMTS13抗体(针对Gln34-Trp688)分别能与重组蛋白在15 kDa处显单一条带。功能实验表明,该重组蛋白能够有效逆转iTTP患者中被自身抗体抑制的ADAMTS13酶活性。结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究spacer区对iTTP的发病机理提供了实验依据。 展开更多
关键词 spacer区域 血管性血友病因子裂解酶 原核表达
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ADAMTS13和血管性血友病因子在血栓性血小板减少性紫癜中的作用 被引量：4
4
作者 马珍妮 凌婧 +2 位作者 殷杰 苏健 阮长耿 《中国血液流变学杂志》 CAS 2016年第4期493-499,共7页
血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP）的发病机制直到ADAMTS13的发现才揭开了超过半世纪的谜底.ADAMTS13主要合成于肝脏,它主要的功能是特异性切割锚定在内皮细胞表面、血液循环中以及血管损伤部位的血... 血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP）的发病机制直到ADAMTS13的发现才揭开了超过半世纪的谜底.ADAMTS13主要合成于肝脏,它主要的功能是特异性切割锚定在内皮细胞表面、血液循环中以及血管损伤部位的血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）.当由于ADAMTS13基因突变或存在ADAMTS13自身抗体而导致血浆中ADAMTS13活性缺失（〈10%）能引起遗传性或获得性（特发性）TTP.在其他形式如继发引起（造血干细胞移植、感染和弥漫性恶性肿瘤）的血栓性微血管病或溶血性尿毒症综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）中ADAMTS13活性通常为正常或中度减少（〉20%）.现今初治方案仍然选择血浆输注或血浆置换,但新的治疗方法如重组的ADAMTS13和基因治疗仍在研制中.另外ADAMTS13活性的缺失已经被认为是发展为心肌梗死、中风、脑型疟疾和先兆子痫的一个风险因素. 展开更多
关键词 金属蛋白酶 动脉血栓形成 血栓性血小板减少性紫癜 突变 自身抗体
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血管性血友病因子裂解酶CUB区的稳定表达及其鉴定
5
作者 马珍妮 董宁征 阮长耿 《中国血液流变学杂志》 CAS 2010年第4期546-548,592,共4页
目的 该研究旨在得到血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的CUB区蛋白,进一步研究其生物功能.方法 利用脂质体将编码CUB区序列的重组质粒pSecTag-CUB转染Hela细胞.用潮霉素（hygromycin-B）筛选得到阳性克隆细胞株,并扩大培养,收集上... 目的 该研究旨在得到血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的CUB区蛋白,进一步研究其生物功能.方法 利用脂质体将编码CUB区序列的重组质粒pSecTag-CUB转染Hela细胞.用潮霉素（hygromycin-B）筛选得到阳性克隆细胞株,并扩大培养,收集上清.利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化产品纯度和免疫学活性.结果 成功获得一株能恒定分泌重组CUB区蛋白的细胞株CUB-7,每1 L培养上清可纯化剑6.0mg重组蛋白.Western blotting结果显示,6×His抗体能与重组蛋白在41kD处显单一条带.结论 重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究CUB区在ADAMTS13中的作用机理和运用奠定了良好的基础. 展开更多
关键词 血管性血友病因子裂解蛋白酶 CUB 直核表达
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糖链结构在神经系统中的功能作用
6
作者 马珍妮 吴士良 《国际病理科学与临床杂志》 CAS 2006年第4期340-342,350,共4页
糖链作为生物信息分子参与细胞生物几乎所有的生命和疾病过程,起特异性的识别、介导、调控等信号转导作用。神经系统发育、神经网络形成、神经再生连接和神经肌肉连接等方面都涉及糖链的参与。糖链在神经系统中发挥着不可取代的作用,而... 糖链作为生物信息分子参与细胞生物几乎所有的生命和疾病过程,起特异性的识别、介导、调控等信号转导作用。神经系统发育、神经网络形成、神经再生连接和神经肌肉连接等方面都涉及糖链的参与。糖链在神经系统中发挥着不可取代的作用,而且糖链又因其结构的多样性、复杂性和微观不均一性引起其功能在神经系统中的多样性。 展开更多
关键词 糖链 神经系统 海马
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有效抑制小胶质细胞上TLR4表达的siRNA筛选及转染复合物细胞毒性的检测 被引量：11
7
作者 刘思兰 杨建平 +8 位作者 王丽娜 刘磊 李彩芳 任春光 周静 李伟 江淼 马珍妮 邱桥成 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期457-465,共9页
目的筛选有效抑制小胶质细胞上TLR4(Toll-like receptor 4)表达的小干扰RNA(simall interference RNA,siR-NA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR4的siRNA4条(siRNA312,siRNA439,siRNA1495,siRNA2062)及1条与TLR4... 目的筛选有效抑制小胶质细胞上TLR4(Toll-like receptor 4)表达的小干扰RNA(simall interference RNA,siR-NA)序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR4的siRNA4条(siRNA312,siRNA439,siRNA1495,siRNA2062)及1条与TLR4基因无同源性的带绿色荧光标记的阴性对照siRNA:在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。用RT-PCR方法测定干扰后小胶质细胞上TLR4mRNA表达,Western blot方法测定干扰后TLR4蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。采用MTT法检测转染复合物的细胞毒性。结果①siRNA(40nmol·L-1)和LipofectamineTM 2000(1μl)有较高的转染效率;②与阴性对照组相比,TLR4 siRNA(40nmol·L-1)干扰小胶质细胞24h后TLR4 mRNA的相对表达量降低,分别为:85%(siRNA439)、73%(siRNA312)、67%(siRNA1495)和33%(siRNA2062)。③siRNA439干扰小胶质细胞48h后TLR4蛋白表达最低(P<0.01)。④LipofectamineTM 20001μl复合低于40nmol·L-1的siRNA的各组细胞存活率均在85%以上。结论①siRNA439对小胶质细胞上TLR4表达的抑制效果最大。②siRNA浓度40nmol·L-1,LipofectamineTM 2000浓度1μl,细胞毒性很低,适合转染。 展开更多
关键词 小胶质细胞 TOLL-LIKE RECEPTOR 4 小干扰RNA 筛选 转染复合物 细胞毒性
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人重组IL-17/His蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性 被引量：8
8
作者 刘高勤 吴鸿雅 +4 位作者 张光波 马泓冰 马珍妮 居颂光 张学光 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期715-718,共4页
目的:研究人IL-17的体外生物学活性。方法:采用RT-PCR的方法克隆得到了hIL-17基因序列。将测序正确的人IL-17基因装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17/PQE3.0。该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生IL... 目的:研究人IL-17的体外生物学活性。方法:采用RT-PCR的方法克隆得到了hIL-17基因序列。将测序正确的人IL-17基因装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17/PQE3.0。该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生IL-17/His融合蛋白,并经West-ernblot实验确认。结果:原核表达的hIL-17/His重组蛋白经变性、复性后,利用HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明,该融合蛋白具有刺激人宫颈癌细胞株HeLa分泌IL-6和GM-CSF的作用。结论:制备了具有生物学活性的IL-17/His重组蛋白,为进一步研究该分子在自身免疫疾病等方面的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 IL-17 原核表达 复性 纯化
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氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子 被引量：6
9
作者 卜梓斌 姜志胜 +10 位作者 马珍妮 董宁征 赵战芝 季顺东 沈飞 江淼 王静 谢丽倩 冯雪娟 陈晶晶 阮长耿 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期636-641,共6页
目的:探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法:实验分为阴性对照组、阳性对照组(加组胺)、HDL、oxHDL 4组,ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL(10-120 mg/L)和组胺(1×10-9-1... 目的:探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法:实验分为阴性对照组、阳性对照组(加组胺)、HDL、oxHDL 4组,ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL(10-120 mg/L)和组胺(1×10-9-1×10-4mol/L)处理不同时间(2-8 h)后,采用实时定量PCR(RQ-PCR)和Western bloting方法检测TF表达。同时,分别应用SP600125[c-Jun氨基端激酶(JNK)特异性抑制剂]、SB203580[p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)特异性抑制剂]、PD98059[细胞外信号调节激酶(ERK1/2)特异性抑制剂],观察其对oxHDL和组胺诱导的ECV304细胞表达TF的影响。结果:正常ECV304细胞未检测到TF,经组胺处理1 h后TF mRNA表达明显增加,在1×10-5mol/L时最高,约为1×10-9mol/L时的4.8倍。oxHDL以时间和浓度依赖性方式诱导ECV304细胞TF mRNA表达,在oxHDL20 mg/L时最高,为10 mg/L时的1.8倍,在第6 h时TF mRNA表达水平为第2 h的5.3倍(P<0.05),并在20 mg/L时显著刺激ECV304细胞TF蛋白表达,为40 mg/L时的1.5倍,而HDL没有此效应。MAPKs(JNK、p38 MAPK、ERK1/2)抑制剂可部分解除oxHDL诱导ECV304细胞TF表达的效应,TF分别下调表达至原来的19.0%、5.0%和13.0%(P<0.05)。结论:oxHDL能以浓度和时间依赖性方式诱导ECV304细胞产生TF,其机制可能通过JNK、p38 MAPK和ERK1/2所介导。 展开更多
关键词 组织因子 脂蛋白类 HDL p38 MAPK通路 ERK 1/2通路 JNK通路
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急性髓系白血病中ADAMTS13活性和vWF的水平变化及其意义 被引量：6
10
作者 张文娟 韩悦 +8 位作者 马珍妮 王倩 唐雅琼 王杰 苏健 孙爱宁 王兆钺 阮长耿 吴德沛 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1503-1507,共5页
本研究观察血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)活性和血管性血友病因子(v WF)抗原在急性髓系白血病(AML)患者治疗前后的变化情况,探讨相关的临床意义。收集73例初治AML患者缓解前后的血浆标本,荧光标记v WF73底物荧光共振能量转移试... 本研究观察血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)活性和血管性血友病因子(v WF)抗原在急性髓系白血病(AML)患者治疗前后的变化情况,探讨相关的临床意义。收集73例初治AML患者缓解前后的血浆标本,荧光标记v WF73底物荧光共振能量转移试验(FRETS-v WF73)检测患者血浆中的ADAMTS13活性,以ELISA试剂盒检测v WF抗原量。结果表明,初治AML患者治疗缓解前的ADAMTS13活性明显低于正常对照组:(63.3±25.5)%vs(105.1±37.7)%,(P<0.01);v WF抗原则高于正常对照组(226.6±127.0)%vs(111.4±39.7)%,(P<0.01)。经标准诱导化疗后缓解期患者的ADAMTS13活性明显高于治疗前组(P<0.01),与正常对照组比较无显著差异;v WF抗原则明显低于治疗前组(P<0.01),但仍高于正常对照组(P<0.05)。初治AML患者治疗前合并感染者的ADAMTS13活性明显低于无感染组:(52.2±20.6)%vs(73.9±24.7)%,(P<0.01);感染组v WF抗原明显高于无感染组:(262.2±135.7)%vs(193.8±110.2)%,(P<0.05)。伴弥散性血管内凝血(DIC)者的ADAMTS13活性明显低于无DIC组:(42.0±14.5)%vs(73.4±22.7)%,(P<0.01);DIC患者的v WF抗原明显高于无DIC组:(274.2±140.0)%vs(204.7±115.5)%,(P<0.05)。结论:初治AML患者治疗前伴有ADAMTS13活性的降低和v WF的升高,以合并感染和DIC的患者表现最显著。ADAMTS13和v WF在肿瘤的发生发展,炎症和DIC的形成过程中起一定作用。 展开更多
关键词 血管性血友病因子裂解蛋白酶 血管性血友病因子 急性髓系白血病 感染 弥散性血管内凝血
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鞘内注射NF-κ B抑制剂对骨癌痛大鼠的抗伤害效应 被引量：6
11
作者 刘思兰 杨建平 +8 位作者 王丽娜 刘磊 李彩芳 任春光 周静 李伟 江淼 马珍妮 邱桥成 《中国疼痛医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期299-303,307,共6页
目的：研究鞘内注射（it） NF-κ B活化抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidme dithiocarbamate,PDTC）对骨癌痛大鼠机械痛敏及脊髓NF-κB表达的影响,探讨NF-κ B在大鼠骨癌痛中的作用.方法：按照本实验室建立的大鼠胫骨癌痛模型建模... 目的：研究鞘内注射（it） NF-κ B活化抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidme dithiocarbamate,PDTC）对骨癌痛大鼠机械痛敏及脊髓NF-κB表达的影响,探讨NF-κ B在大鼠骨癌痛中的作用.方法：按照本实验室建立的大鼠胫骨癌痛模型建模.雌性SD大鼠96只,体重150～180 g,按照数字表随机化的原则将大鼠分为4组（n=24）：正常对照组（N组）、骨癌痛组（BP组）、生理盐水组（S组）和NF-κB抑制剂组（PDTC组）.BP组于大鼠左侧胫骨干骺端骨髓腔内注射5μlWalker256（1×10^5）乳腺癌细胞制备骨癌痛模型,N组仅左胫骨上端注入5 μl Hank＇s液.于接种后9d鞘内注射生理盐水10 μl或PDTC 20 μg/10μl（生理盐水溶解）,2次/d,共3d.于接种前、后2、4、6、9和12d、鞘内给药后1、3、6、12、24 h采用von Frey丝测定大鼠术侧后爪机械缩足反射阈值（paw withdrawal threshold,PWT）,PWT测定结束后处死大鼠,取L4～6脊髓,采用real time-PCR法测定NF-κ B p65 mRNA表达,免疫组化法测定NF-κ B p65蛋白表达.结果：接种后6dBP组大鼠的PWT值与基础值相比开始降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）,随着接种时间的延长其下降更加显著.鞘内注射PDTC可显著提高骨癌痛大鼠的PWT值,且与没注射PDTC前PWT值比,差异有统计学意义（P＜0.05）.与接种后6d时相比较,骨癌痛大鼠脊髓NF-κ B p65 mRNA和蛋白质的表达在接种后9d （P＜0.01）和12d（P＜0.01）时均显著上调,而鞘内注射PDTC可显著降低大鼠脊髓NF-κ B p65 mRNA和蛋白质的表达（P＜0.01）.结论：鞘内注射PDTC可减轻大鼠骨癌痛引起的痛敏,NF-κ B的激活可诱导或促进大鼠的胫骨癌痛. 展开更多
关键词 NF-κB 骨肿瘤 疼痛
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人外周血来源的过度生长内皮细胞的分离、培养及鉴定 被引量：3
12
作者 殷杰 马珍妮 +1 位作者 赵小娟 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期1711-1715,共5页
与内皮干细胞相比,外周血来源的过度生长内皮细胞(blood outgrowth endothelial cells,BOECs)富含血管新生和细胞黏附所需的蛋白,生物学特性更像内皮细胞;同时它克服了成熟的人脐血内皮细胞体外培养扩增量少和表型易发生改变的缺点,成... 与内皮干细胞相比,外周血来源的过度生长内皮细胞(blood outgrowth endothelial cells,BOECs)富含血管新生和细胞黏附所需的蛋白,生物学特性更像内皮细胞;同时它克服了成熟的人脐血内皮细胞体外培养扩增量少和表型易发生改变的缺点,成为一种研究血管异常相关性疾病的新工具。本研究旨在建立从人外周血中体外培养、扩增BOECs,并进行鉴定的方法。采集外周血,梯度离心获得单个核细胞,接种于胶原铺板的细胞培养皿上,EGM-2培养4周。观察BOECs的形态学特征,流式细胞术分析细胞表面抗原表达。血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)多聚体分析BOECs上清v WF多聚体分布,荧光共聚焦显微镜鉴定细胞内v WF的贮存及v WF的刺激分泌。结果表明,体外诱导培养4周左右,出现克隆性生长的细胞集落,BOECs呈现"铺路石"样外观。经过3周左右的扩增后,过度生长的内皮细胞表达CD31、CD34、EPCR阳性,CD14、CD45、CD133阴性。收集BOECs上清,进行v WF多聚体分析,与正常血浆相比v WF多聚体分布无差异。在荧光共聚焦显微镜下观察,BOECs内贮存v WF,加入佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激后,细胞内v WF增加,细胞表面可见v WF丝状结构。结论:本研究运用该实验方法在国内首次实现了人BOECs的体外培养、扩增及鉴定。该方法可以为血管性血友病病人发病机制的探讨提供天然的细胞模型,并可能为病人基因治疗提供新工具。 展开更多
关键词 外周血 过度生长内皮细胞 细胞表型 血管性血友病因子
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重组hIL-17F原核蛋白表达和生物学活性初步研究 被引量：2
13
作者 刘高勤 吴鸿雅 +3 位作者 李龙标 马珍妮 陆培荣 张学光 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期263-265,269,共4页
目的:研制hIL-17F/His重组蛋白并初步研究其体外生物学活性。方法:RT-PCR法克隆得到hIL-17F基因序列。将测序正确的hIL-17F基因片段装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17F/PQE3.0。将该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基B-D硫代半乳... 目的:研制hIL-17F/His重组蛋白并初步研究其体外生物学活性。方法:RT-PCR法克隆得到hIL-17F基因序列。将测序正确的hIL-17F基因片段装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17F/PQE3.0。将该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基B-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后产生hIL-17F/His重组蛋白,并用Western blot实验确认。结果:原核表达的hIL-17F/His重组蛋白变性、复性后,经过HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-6等分子表达的作用,并促进He-La细胞的增殖。结论:制备了具有生物学活性的hIL-17F/His重组蛋白,为进一步研究该分子独特的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 IL-17F 原核表达 复性 纯化
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多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2酵母双杂交载体构建及激活检测 被引量：1
14
作者 沈宏杰 杭赛宇 +2 位作者 孙其昌 马珍妮 吴士良 《江苏大学学报（医学版）》 CAS 2005年第3期195-197,共3页
目的:为探讨O糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用,构建pGADT7/ppGalNAc T2载体,并转化酵母AH109进行激活检测。方法:采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAc T2全长编码序列,亚克隆至酵母双杂交载体pGADT7,醋酸锂法转染酵母AH109,并进行... 目的:为探讨O糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用,构建pGADT7/ppGalNAc T2载体,并转化酵母AH109进行激活检测。方法:采用PCR技术从pDONR201T2得到ppGalNAc T2全长编码序列,亚克隆至酵母双杂交载体pGADT7,醋酸锂法转染酵母AH109,并进行激活检测。结果:酶切图谱分析和基因测序证实pGADT7/ppGal NAc T2载体构建成功。并转化酵母AH109,激活检测呈阴性。结论:成功构建了pGADT7/ppGalNAc T2载体,并进行了激活检测,为进一步研究ppGalNAc T2的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 酵母双杂交 载体构建 半乳糖转移酶 ppGalNAc-T2 检测 激活 乙酰氨基 多肽 全长编码序列 酶切图谱分析 O-糖基化 PCR技术 发生发展 基因测序 亚克隆 步研究 转化
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膜型基质金属蛋白酶在人血管内皮细胞株中的表达 被引量：2
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作者 蒋菊香 胡晓慧 +3 位作者 马珍妮 董宁征 白霞 阮长耿 《苏州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第2期172-175,202,共5页
目的 探讨膜型基质金属蛋白酶（memberane-type matrix metalloproteinases,MT-MMPs）在内皮细胞中的作用。方法 用Clustal W软件（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw）比较6种MT-MMPs的蛋白序列同源性,并描绘出进化树,用半定量逆转录-聚... 目的 探讨膜型基质金属蛋白酶（memberane-type matrix metalloproteinases,MT-MMPs）在内皮细胞中的作用。方法 用Clustal W软件（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw）比较6种MT-MMPs的蛋白序列同源性,并描绘出进化树,用半定量逆转录-聚合酶链式反应技术检测HMEC-1、ECV304和EAhy926 3株内皮细胞株中MT-MMPs的mRNA表达差异。结果 蛋白质序列同源比较结果 提示,MT-MMPs各成员间氨基酸一致性为31%-65%,RT-PCR检测结果 发现6种MT-MMPs在3株不同细胞中呈现不同的表达谱。结论 MT-MMPs在不同血管内皮细胞株中的表达差异,可能与各内皮细胞不同的来源、表型特点和各自具有不同的功能有关。 展开更多
关键词 膜型基质金属蛋白酶 内皮细胞株 进化树 表达
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抗ADAMTS13单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 被引量：1
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作者 凌婧 马珍妮 +4 位作者 殷杰 沈飞 谢丽倩 赵云霄 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期1123-1129,共7页
目的:建立分泌抗ADAMTS13单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备针对ADAMTS13不同结构域的单克隆抗体。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠。用ELISA方法测定免疫小鼠与ADAMTS13-T7蛋白... 目的:建立分泌抗ADAMTS13单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备针对ADAMTS13不同结构域的单克隆抗体。方法:利用真核表达的重组血浆金属蛋白酶ADAMTS13截短型蛋白(ADAMTS13-T7)纯品免疫BALB/c小鼠。用ELISA方法测定免疫小鼠与ADAMTS13-T7蛋白的抗血清效价。取小鼠脾脏,制成单细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合,进行细胞的融合,并将杂交瘤细胞稀释培养。2周后选生长良好的克隆孔检测,阳性克隆孔扩大培养并再次检测。结果:获得真核表达截短型血管性血友病因子裂解蛋白酶ADAMTS13-T7蛋白纯品。利用真核表达的截短型ADAMTS13-T7蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA检测免疫后抗血清效价约为1∶20 000。利用杂交瘤技术通过融合,获得多株分泌抗重组ADAM TS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株。将其中的30株转入液氮中冻存,以备进一步分选及功能研究。结论:融合获得多株分泌抗重组ADAMTS13抗体的杂交瘤单克隆细胞株,为进一步筛选出具有一定功能活性的单克隆抗体及研究ADAMTS13结构和功能提供更多的有力工具。 展开更多
关键词 ADAMTS13 真核表达 杂交瘤 单克隆抗体
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膜型基质金属蛋白酶亚家族和基质金属蛋白酶-2在人恶性造血细胞株中的表达谱及其相关性 被引量：1
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作者 蒋菊香 马珍妮 +4 位作者 胡晓慧 董宁征 白霞 吴士良 阮长耿 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期574-580,共7页
为探讨不同恶性血液病中膜型基质金属蛋白酶(memberane-type matrix metalloproteinases,MT-MMPs)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达差异,用半定量RT-PCR检测了13株不同谱系恶性造血细胞株中MT-MMPs和MMP-2的... 为探讨不同恶性血液病中膜型基质金属蛋白酶(memberane-type matrix metalloproteinases,MT-MMPs)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达差异,用半定量RT-PCR检测了13株不同谱系恶性造血细胞株中MT-MMPs和MMP-2的mRNA表达差异.明胶酶谱法分析各细胞株MMP-2的酶活,并用流式细胞术检测了MT1-MMP蛋白的表达,用SPSS10.0分析了各基因的表达与细胞来源的相关性和各基因相互间表达的相关性.结果提示,各种MT-MMPs和MMP-2在13株细胞中呈现不同的表达谱,其中MT2-、MT4-、MT1-MMP和MMP-2表达较广泛,而MT3-、MT5-、MT6-MMP在检测的细胞株中较少表达.统计分析显示,MT-MMPs和MMP-2的表达与细胞的来源无明显的相关性(P>0.1),而MT1-MMP和MMP-2的表达有相关性(P<0.05).同时也发现,MT3-MMP和MT5-MMP的表达有相关性(P<0.05).MT-MMPs在恶性造血细胞中的表达差异,提示它们在不同类型的血液系统肿瘤发展中发挥各自独特的作用.另外,MT1-MMP和MMP-2,MT3-MMP和MT5-MMP之间表达的相关性提示,它们在功能上密切相关. 展开更多
关键词 MT—MMPs MMP-2 恶性造血细胞株 表达
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人血管性血友病因子裂解蛋白酶pEGFP-N1真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 被引量：1
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作者 凌婧 马珍妮 +1 位作者 苏建 阮长耿 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期126-129,共4页
本研究旨在构建人血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)的pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13在细胞内合成及其分泌提供有力工具。通过PCR方法获取目的基因片段,并在目的基因两端加上限制性酶切位点。限制性内切酶酶切后,连接... 本研究旨在构建人血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)的pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13在细胞内合成及其分泌提供有力工具。通过PCR方法获取目的基因片段,并在目的基因两端加上限制性酶切位点。限制性内切酶酶切后,连接至pEGPF-N1真核表达载体。连接后获得质粒进行酶切鉴定及DNA测序验证,并转染HeLa细胞。通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达,Western blot方法鉴定所得蛋白。结果表明,酶切鉴定及DNA测序确认目的基因与载体正确连接,在荧光显微镜下观察到绿色荧光。Western blot显示,转染后HeLa细胞表达ADAMTS13蛋白。结论:成功构建了ADAMTS13-pEGFP-N1真核表达载体,为进一步研究ADAMTS13合成、分泌及其代谢的生理学机制提供了研究工具。 展开更多
关键词 ADAMTS13 pEGFP-N1载体 载体构建 HELA细胞
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人4IgB7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究 被引量：1
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作者 马震宇 周迎会 +7 位作者 陈永井 费敏 马珍妮 王勤 王雪峰 马泓冰 谢芳 张学光 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期109-114,共6页
为获得人4IgB7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用,采用PCR技术分别从pMD18-T/4IgB7-H3和pMD18-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出人4IgB7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因,通过RT-PCR技术插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆... 为获得人4IgB7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用,采用PCR技术分别从pMD18-T/4IgB7-H3和pMD18-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出人4IgB7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因,通过RT-PCR技术插入逆转录病毒载体pGEZ-Term,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体经脂质体法共转染包装细胞293T,收集含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清反复感染L929细胞,利用Zeocin筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞。基因转染细胞经无血清培养后,收集的上清用Dot blot检测,超滤浓缩并经Protein G柱纯化,再用SDS-PAGE、Western blot鉴定。以4IgB7-H3-Fc蛋白检测活化T细胞表面未知受体的表达,通过MTT方法分析4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用。结果显示,成功地构建了pEGZ-Term/4IgB7-H3-Fc重组逆转录病毒载体,经转染包装细胞293T后,筛选获得能稳定分泌4IgB7-H3-Fc蛋白的L929基因转染细胞株;纯化后的4IgB7-H3-Fc蛋白能够与活化T细胞表面结合,并对T细胞有显著的促增殖作用。为探讨人4IgB7-H3-Fc融合蛋白对T细胞的共刺激作用和寻找其未知受体奠定良好的物质基础。 展开更多
关键词 4IgB7-H3 RT-PCR基因转染 融合蛋白 共刺激
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实时定量PCR分析MT1-MMP/TIMP-2/MMP-2在不同来源人血管内皮细胞株中的表达 被引量：2
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作者 蒋菊香 马珍妮 +2 位作者 胡晓慧 董宁征 阮长耿 《中国血液流变学杂志》 CAS 2007年第1期7-10,共4页
为深入研究MT1-MMP在血管生物学中的功能,该研究比较了MT1-MMP及与其功能相关MMP-2、TIMP-2在人微血管内皮细胞株HMEC-1和人大血管内皮细胞株EAhy926、ECV304中的mRNA表达差异。实时定量PCR分析显示3株细胞均表达MT1-MMP与TIMP-2,其中MT... 为深入研究MT1-MMP在血管生物学中的功能,该研究比较了MT1-MMP及与其功能相关MMP-2、TIMP-2在人微血管内皮细胞株HMEC-1和人大血管内皮细胞株EAhy926、ECV304中的mRNA表达差异。实时定量PCR分析显示3株细胞均表达MT1-MMP与TIMP-2,其中MT1-MMP在EAhy926中表达最高,TIMP-2在3株细胞中呈现相似的表达量,在ECV304中相对表达较高,而仅在EAhy926中检测到MMP-2的高表达。MT1-MMP和MMP-2在典型的大血管内皮细胞株EAhy926中的高表达可能与该类内皮细胞独特的来源、表型特点和功能有关。 展开更多
关键词 MT1-MMP 内皮细胞株 实时定量PCR
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