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比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析 被引量：1
1
作者 吴泽航 杨中义 +3 位作者 鄢毅铖 贾永红 吴月燕 谢晓鸿 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期251-259,共9页
【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎... 【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。 展开更多
关键词 比利时杜鹃花 类黄酮3’-羟化酶(F3’H) 花青素 亚细胞定位 瞬时表达
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红比利时杜鹃愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系构建及植株再生 被引量：2
2
作者 何凡 吴月燕 +5 位作者 谢晓鸿 杨国霞 蒋宝鑫 李东宾 鄢毅铖 贾永红 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期1546-1558,共13页
为建立红比利时杜鹃花愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,以嫩叶为材料,探讨了愈伤组织诱导与增殖的条件,构建并评价了愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,同时诱导愈伤颗粒出芽、生根,并获得组培小苗。结果表明,在2.41 g·L^(-1)木本植物基本培养基(... 为建立红比利时杜鹃花愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,以嫩叶为材料,探讨了愈伤组织诱导与增殖的条件,构建并评价了愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,同时诱导愈伤颗粒出芽、生根,并获得组培小苗。结果表明,在2.41 g·L^(-1)木本植物基本培养基(WPM)+20 g·L^(-1)蔗糖+10 g·L^(-1)麦芽糖+7.0 g·L^(-1)琼脂+0.050 mg·L^(-1)植物组培抗菌剂(PPM)为基本培养基的条件下,嫩叶愈伤组织诱导的生长调节剂最优方案为:0.3 mg·L^(-1)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.3 mg·L^(-1)噻重氮苯基脲(TDZ),此时愈化率可达97.78%;愈伤组织继代增殖的生长调节剂方案为:0.61 mg·L^(-1)2,4-二氧苯氧乙酸(2,4-D)+0.65 mg·L^(-1)6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1.37 mg·L^(-1) TDZ,此时增殖率可达167%。将继代5次后呈疏松状的愈伤颗粒接种于液体继代培养基中,大约4~12 d后愈伤颗粒进入指数生长阶段,增殖率为45%。含有GUS基因的pRI 101-AN与含有GFP基因的pCAMBIA1301-GFP分别在农杆菌GV3101介导下转化处于指数生长期的愈伤悬浮颗粒,OD_(600)为0.6的农杆菌侵染液侵染15 min后,愈伤颗粒的GUS染色效率为26.28%,愈伤颗粒的GFP荧光表达效果明显。另外,以2.41 g·L^(-1) WPM+7 g·L^(-1)琼脂+20 g·L^(-1)蔗糖为基本培养基,添加2.0 mg·L^(-1)TDZ+0.5 mg·L^(-1)2,4-D时,可诱导愈伤组织不定芽;以1/2 Read为基本培养基,添加0.5 mg·L^(-1) IBA+1 g·L^(-1)活性炭可诱导出芽的愈伤颗粒生根。本研究结果为进一步开展红比利时杜鹃花稳定遗传转化研究和转基因植株培育奠定了基础。 展开更多
关键词 红比利时杜鹃 愈伤悬浮颗粒 瞬时转化 再生
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比利时杜鹃类黄酮3-O-糖基转移酶基因的克隆、原核表达及功能分析
3
作者 鄢毅铖 吴泽航 +5 位作者 姜宇航 胡高源 杨宇杰 谢晓鸿 吴月燕 贾永红 《生物工程学报》 北大核心 2025年第2期881-895,共15页
类黄酮3-O-糖基转移酶是植物花青素糖苷化的关键酶。为研究杜鹃花3GT基因的功能,本研究从红比利时杜鹃中克隆了一个3GT基因开放阅读框(open reading frame,ORF)命名为Rh3GT,分析、测定并验证了该ORF及其编码蛋白的理化性质、表达水平、... 类黄酮3-O-糖基转移酶是植物花青素糖苷化的关键酶。为研究杜鹃花3GT基因的功能,本研究从红比利时杜鹃中克隆了一个3GT基因开放阅读框(open reading frame,ORF)命名为Rh3GT,分析、测定并验证了该ORF及其编码蛋白的理化性质、表达水平、酶学功能等生物学特性。结果表明,Rh3GT全长993 bp,编码330个氨基酸;编码蛋白为亲水稳定的弱酸性蛋白,隶属糖基转移酶家族(GT-B型),PSPG box结构域中第44位为谷氨酰胺(Q);系统进化分析发现比利时杜鹃Rh3GT与越橘Vc3GT和黑果越橘Vm3GT的亲缘关系最近;Rh3GT在根中几乎不表达,在茎、叶、花中均有表达,且在盛开期花瓣中表达量最高;花瓣瞬时过表达Rh3GT后发现其总花青苷积累也显著增加;Rh3GT重组蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达,并以包涵体形式存在,大小约为36 kDa,与理论预测值接近;高效液相色谱检测发现,经过变性纯化和稀释复性后的Rh3GT重组蛋白可催化矢车菊素和UDP-葡萄糖合成矢车菊素3-O-葡萄糖苷,表明表达的蛋白具有3GT活性。本研究为深入探讨杜鹃花花青苷生物合成分子调控机制提供了基础数据,并为潜在的杜鹃花分子育种提供了理论支持。 展开更多
关键词 比利时杜鹃 类黄酮3-O-糖基转移酶 表达分析 瞬时过表达 原核表达
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