A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测

1

作者 郭玉堃 明胜利 +2 位作者 郭婉莹 杨国宇 郭豫杰 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期726-731,共6页

目的本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Camp... 目的本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS。构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDSPAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白。重组蛋白通过NiNTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法。 展开更多

关键词 A型口蹄疫病毒 1D蛋白 铁蛋白 融合标签 可溶性 纳米颗粒 电子显微术 大肠埃希菌

在线阅读 下载PDF 职称材料

O型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及纳米样结构观察

2

作者 郭玉堃 明胜利 +2 位作者 郭婉莹 杨国宇 郭豫杰 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期118-123,共6页

目的本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135... 目的本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为Se Fnt16798。构建了Se Fnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、Ce HSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的Se Fnt16798融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果实验成功构建9个Se Fnt16798表达载体;9个标签中,MBP与Se Fnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-Se Fnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-Se Fnt16798形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得Se Fnt16798重组蛋白质的方法。 展开更多

关键词 O型口蹄疫病毒 VP1蛋白 铁蛋白 融合标签 纳米颗粒 电子显微镜 大肠埃希菌

在线阅读 下载PDF 职称材料

干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响 被引量：4

3

作者 侯璐 王一 +9 位作者 张爽 李国利 曾磊 郭玉堃 翟云云 于朋伟 王棋 王春凤 杜永坤 万博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2273-2282,共10页

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)... 研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为106.2 TCID50·0.1 mL^-1,STING基因敲除细胞的病毒滴度为108.3TCID50·0.1 mL^-1,病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 干扰素基因刺激因子 猪肺巨噬细胞 伪狂犬病病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

“软硬兼施,开放共享”畜牧兽医类专业智慧学习空间的搭建与应用——以宠物诊疗专业为例

4

作者 郭玉堃 陈龙保 +1 位作者 魏通 朱金凤 《河南农业》 2023年第21期31-33,共3页

在“互联网+教育”的时代背景下,社会对人才的需求不仅是拥有专业技能,更注重人才的综合素质和学习能力。智慧学习空间是提升学生综合素质和专业技能的有效途径。以宠物诊疗专业为例,采用虚实结合的方式搭建了以学生为中心的“软硬兼施... 在“互联网+教育”的时代背景下,社会对人才的需求不仅是拥有专业技能,更注重人才的综合素质和学习能力。智慧学习空间是提升学生综合素质和专业技能的有效途径。以宠物诊疗专业为例,采用虚实结合的方式搭建了以学生为中心的“软硬兼施,开放共享”的智慧学习空间,为学生的学习、教师的教学、企业的招聘提供帮助。 展开更多

关键词 高职教育 智慧学习空间 宠物诊疗

在线阅读 下载PDF 职称材料

猪肾上皮细胞Ⅰ型干扰素受体1敲除对伪狂犬病毒复制的影响

5

作者 邵科宇 张爽 +6 位作者 段利芳 马英先 郭玉堃 李佳佳 刘晓贺 杜永坤 褚贝贝 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期741-746,共6页

目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-tim... 目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证。结果随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。结论IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用。 展开更多

关键词 猪肾上皮细胞 Ⅰ型干扰素受体1 伪狂犬病病毒 基因编辑 免疫印迹法 实时定量聚合酶链反应 猪

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备

6

作者 贾宾 陈慧心 +3 位作者 韩莹倩 郭玉堃 邵科宇 郭豫杰 《江西农业学报》 CAS 2019年第3期1-9,共9页

利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促... 利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。 展开更多

关键词 Spyligase技术 流感血凝素H5HA10 原核表达 融合标签 多聚体

在线阅读 下载PDF 职称材料

校企共建“资源工厂”模式探索与实践——以洛阳职业技术学院宠物诊疗专业为例

7

作者 魏通 郭玉堃 朱金凤 《河南农业》 2023年第33期10-11,14,共3页

在职业教育“教随产出、产教同行”的时代背景下,校企融合共建“资源工厂”凸显其重要意义。“资源工厂”是校企培养高技能型人才、进一步实现产教融合的重要载体。以洛阳职业技术学院宠物诊疗技术专业为例,进行校企融合、共建“资源工... 在职业教育“教随产出、产教同行”的时代背景下,校企融合共建“资源工厂”凸显其重要意义。“资源工厂”是校企培养高技能型人才、进一步实现产教融合的重要载体。以洛阳职业技术学院宠物诊疗技术专业为例,进行校企融合、共建“资源工厂”、创新教学资源建设模式探索,形成“三共建、一打造”实践路径,以期为高职院校宠物诊疗技术专业培养高水平技能型人才提供新路径。 展开更多

关键词 职业教育 校企共建 资源工厂 产教融合

在线阅读 下载PDF 职称材料

超声弹性成像技术鉴别犬肿块良恶性的应用 被引量：1

8

作者 魏通 郭玉堃 +3 位作者 黄静 赫亚歌 王朝阳 邓立新 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1586-1592,1602,共8页

选取宠物临床符合要求的犬肿块病例108例进行超声影像学研究,然后进行组织病理切片检查,最后对结果进行统计学分析。研究结果为应用超声弹性成像技术诊断肿块良恶性的准确率为94.4%(102/108);应用传统超声技术(即二维灰阶超声、彩色血... 选取宠物临床符合要求的犬肿块病例108例进行超声影像学研究,然后进行组织病理切片检查,最后对结果进行统计学分析。研究结果为应用超声弹性成像技术诊断肿块良恶性的准确率为94.4%(102/108);应用传统超声技术(即二维灰阶超声、彩色血流多普勒超声)判定肿块良恶性的准确率分别为33.3%、55.5%,传统超声技术与超声弹性成像技术结果比较差异极显著(P<0.01)。结果表明,超声弹性成像技术在鉴别犬肿块良恶性方面与传统超声技术相比有着明显的特异性和准确性,该技术可作为今后宠物临床犬肿块良恶性的一种重要鉴别方法。本试验为提升宠物临床肿块性疾病的鉴别诊断水平有着一定的参考价值。 展开更多

关键词 超声 弹性成像技术 犬 肿块

原文传递

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析 被引量：7

9

作者 郭玉堃 郭婉莹 +2 位作者 明胜利 郭豫杰 杨国宇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期609-617,共9页

为表达出高可溶性的GP5／M蛋白并检测其免疫原性，本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱... 为表达出高可溶性的GP5／M蛋白并检测其免疫原性，本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计，构建了GP5／M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导，SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的GP5／M融合蛋白。重组蛋白通过NiNTAAgarose亲和纯化，免疫家兔，对获得的免抗GP5／M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示，成功构建10个GP5／M表达载体，10个标签中，MBP与GP5／M蛋白相融合的可溶性表达效果最好，并获得了高纯度的MBP—GP5／M重组蛋白质；通过免疫家兔，检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明，试验成功建立了稳定获得GPS／M重组蛋白质的方法，初步鉴定了重组蛋白的免疫效力，为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。 展开更多

关键词 PRRSV GP5/M蛋白 融合标签 免疫原性 中和抗体

原文传递

O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及电镜检测 被引量：3

10

作者 郭玉堃 郭婉莹 +2 位作者 明胜利 杨国宇 郭豫杰 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1265-1271,共7页

本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白，并通过电镜检测，以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列，得到FMDVO／GER／Wup／82株的衣壳蛋白基因，并进行截短和优化，共133个氨基酸；同时，从肠道沙门菌（Salmone... 本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白，并通过电镜检测，以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列，得到FMDVO／GER／Wup／82株的衣壳蛋白基因，并进行截短和优化，共133个氨基酸；同时，从肠道沙门菌（Salmonella enterica）中分离得到135个氨基酸铁蛋白（Ferritin）基因片段，将O型FMDV衣壳蛋白与铁蛋白串联，设计并合成了FMDV衣壳蛋白-铁蛋白基因片段，命名为SeFntl6599。构建了SeFnt16599融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、7-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导，SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的SeFnt16599融合蛋白。重组蛋白通过Ni—NTA Agarose亲和纯化，进行电镜检测。结果表明，成功构建9种SeFnt16599表达载体；9个标签中，MBP与SeFnt16599蛋白相融合的可溶性表达效果最好，并获得了高纯度的MBP—SeFnt16599重组蛋白质；电镜结果显示，MBP—SeFnt16599形成了纳米样颗粒。本试验建立了稳定获得SeFnt16599重组蛋白质的试验方法，为FMDV衣壳蛋白新型结构疫苗的开发及后续研究奠定了基础。 展开更多

关键词 O型口蹄疫病毒 衣壳蛋白 铁蛋白 融合标签 可溶性 纳米颗粒

原文传递

水疱性口炎病毒核蛋白的纳米抗体和多聚抗核蛋白纳米抗体的原核表达及功能验证 被引量：3

11

作者 郭玉堃 马英先 +3 位作者 常雯茹 明胜利 杨国宇 郭豫杰 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1762-1769,共8页

分别制备出高可溶性的抗水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)核蛋白纳米抗体VSVNb和重组截短型铁蛋白与抗VSV核蛋白串联的多聚纳米抗体的融合蛋白FnL-VSV,并对融合蛋白VSVNb和FnL-VSV在VSV诊断中的应用进行了初步探索。从羊... 分别制备出高可溶性的抗水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)核蛋白纳米抗体VSVNb和重组截短型铁蛋白与抗VSV核蛋白串联的多聚纳米抗体的融合蛋白FnL-VSV,并对融合蛋白VSVNb和FnL-VSV在VSV诊断中的应用进行了初步探索。从羊驼(Vicugna pacos)中获得抗VSV核蛋白的纳米抗体序列,命名为VSVNb;从激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)中分离出来的铁蛋白(encapsulin)进行截短后,和从羊驼中获得的抗VSV核蛋白的纳米抗体序列进行串联,命名为FnL-VSV。载体构建后用大肠杆菌表达系统进行融合蛋白的原核表达,经Ni2+纯化后获得单一纳米抗体VSVNb;经硫酸铵盐析纯化得到单一融合蛋白FnL-VSV,并进行电镜检测。将制备的重组蛋白VSVNb和FnL-VSV分别进行HRP标记后,和VSV毒株用作直接ELISA试验。结果表明,原核表达与纯化后获得了纯度较高的融合蛋白VSVNb和FnL-VSV;电镜结果显示,重组蛋白FnL-VSV自组装形成了直径为20 nm纳米样颗粒;直接ELISA检测结果表明,在抗原浓度一定的条件下,重组蛋白VSVNb和FnL-VSV均与特异性抗原VSV毒株在较低浓度条件下结合,具有较高活性,且重组蛋白FnL-VSV比VSVNb D450 nm数值更大;而在重组蛋白VSVNb和FnL-VSV浓度一定的条件下,其能敏感的识别低浓度到高浓度区间的特异性抗原。本试验建立了稳定获得重组蛋白VSVNb和FnL-VSV重组蛋白质的方法,并初步探索了其在直接ELISA中的使用。成功制备了重组蛋白VSVNb和FnL-VSV,为进一步研究纳米抗体在VSV的诊断及后续抗病毒药物的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 水疱性口炎病毒 核蛋白 纳米抗体 铁蛋白 直接ELISA

原文传递

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析 被引量：7

12

作者 李赛赛 郭玉堃 +3 位作者 舒静超 曾磊 郭婉莹 郭豫杰 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2281-2287,共7页

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化... 为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白 融合标签 可溶性表达 LS3蛋白笼纳米颗粒 免疫原性

原文传递