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自组装固定化多聚磷酸激酶用于合成ATP和GTP
1
作者 胥睿睿 杨凤玲 +4 位作者 孙晓源 卢杰 王阳 康振 李江华 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第2期77-82,共6页
多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase)能够利用广泛分布、成本低廉且稳定的多聚磷酸盐作为磷酸基供体,用于合成ATP和GTP,后者为细胞提供必要的能量并参与合成众多含磷酸重要化合物。该文旨在借助合成生物学新技术,通过多聚磷酸激酶催化... 多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase)能够利用广泛分布、成本低廉且稳定的多聚磷酸盐作为磷酸基供体,用于合成ATP和GTP,后者为细胞提供必要的能量并参与合成众多含磷酸重要化合物。该文旨在借助合成生物学新技术,通过多聚磷酸激酶催化、高效廉价地合成ATP和GTP。首先根据不同多聚磷酸激酶家族对不同底物催化能力的分析,筛选了属于多聚磷酸激酶第二家族、来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的聚磷酸激酶Dr PPK2,验证了其同时合成ATP和GTP的活性。接着优化了反应体系中的pH值、Mg^(2+)浓度和催化温度,大幅提高了其合成GTP的效率,最高转化率>92%。为了简化催化流程、节约合成成本,通过添加自组装标签CipA,实现了Dr PPK2的自组装固定化,通过离心可获得高纯度蛋白并实现酶的重复利用,首轮转化率>90%,有效重复效率超过10次。该研究提供了一种方便、高效且易于扩大规模的ATP和GTP生物合成自组装固定化系统,为其他含磷酸的化合物合成提供了借鉴。 展开更多
关键词 聚磷酸激酶 ATP GTP 催化体系优化 自组装固定化
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蜡样芽孢杆菌胶原蛋白水解酶异源表达与胶原蛋白肽酶法制备
2
作者 刘平 胥睿睿 +3 位作者 黄浩 唐瑶 王阳 康振 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第7期9-15,39,共8页
胶原蛋白肽广泛应用于化妆品与保健品,主要依赖于物理和化学降解法制备。相比较,酶法降解制备胶原蛋白肽由于降解条件温和、分子质量可控等特点具有更大优势。该研究旨在挖掘并实现一种具有商业化潜在价值的胶原蛋白水解酶的高效表达制... 胶原蛋白肽广泛应用于化妆品与保健品,主要依赖于物理和化学降解法制备。相比较,酶法降解制备胶原蛋白肽由于降解条件温和、分子质量可控等特点具有更大优势。该研究旨在挖掘并实现一种具有商业化潜在价值的胶原蛋白水解酶的高效表达制备,实现胶原蛋白肽的酶法制备。首先,通过密码子优化合成了蜡样芽孢杆菌来源的胶原蛋白水解酶ColVD021编码基因,通过N-端序列截短优化,实现了ColVD021-Δ30在大肠杆菌中的活性表达(8.96±0.21) U/mL。进一步通过优化添加金属离子Zn^(2+)和Ca^(2+),ColVD021-Δ30的表达水平提高至(16.24±0.21) U/mL。在此基础上,确定了ColVD021-Δ30的最适pH为7.5,最适温度为37℃。酶解结果表明,重组ColVD021-Δ30对不同来源的胶原蛋白均具有高降解活力,胶原蛋白肽分子质量均低于1 000 Da。此外,农副产品鸡胸软骨的酶解结果表明,ColVD021-Δ30可以直接水解粉碎的新鲜鸡胸软骨生产胶原蛋白肽。该研究实现了蜡样芽孢杆菌胶原蛋白水解酶的高效表达,并建立了胶原蛋白肽的酶法制备工艺,为工业化酶法生产胶原蛋白肽提供了解决方案。 展开更多
关键词 胶原蛋白水解酶 表达优化 金属离子 水解条件优化 低分子质量胶原蛋白肽
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结核分枝杆菌腺苷磷酰硫酸激酶的异源活性表达和酶学性质
3
作者 胥睿睿 王阳 +1 位作者 史仲平 康振 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期49-56,共8页
PAPS是生物体内磺化反应的惟一活性磺酸基团供体。腺苷磷酰硫酸激酶是催化APS和ATP生成PAPS和ADP的一类酶。为实现PAPS的酶法合成,作者通过密码子优化来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis AUSMDU00018547)的腺苷磷酰硫酸激酶... PAPS是生物体内磺化反应的惟一活性磺酸基团供体。腺苷磷酰硫酸激酶是催化APS和ATP生成PAPS和ADP的一类酶。为实现PAPS的酶法合成,作者通过密码子优化来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis AUSMDU00018547)的腺苷磷酰硫酸激酶编码基因与共表达硫氧还蛋白TrxB,实现了腺苷磷酰硫酸激酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的异源高活性表达。采用His-Tag标签实现了对腺苷磷酰硫酸激酶的纯化,进一步酶学性质分析结果表明,重组腺苷磷酰硫酸激酶最适温度、最适pH以及比酶活分别为35℃、7.5和(1.26±0.08)U/mg。腺苷磷酰硫酸激酶的异源活性表达与酶学性质分析为未来实现酶法合成PAPS奠定了基础。 展开更多
关键词 PAPS 腺苷磷酰硫酸激酶 结核分枝杆菌 活性表达 活性分析
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细菌酪氨酸酶高效异源表达及其在生物染发和丝素多肽多巴修饰中的应用 被引量：2
4
作者 郑依琳 胥睿睿 +3 位作者 王阳 方承格 堵国成 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期3083-3102,共20页
酪氨酸酶是一种含铜的多酚氧化酶,广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前商品化酪氨酸酶主要依赖于真菌提取,存在价格高、纯度低、比酶活低和稳定性差等问题。本研究旨在获得高效表达并具有工业化应用前景的细菌酪氨酸酶。通过在大肠... 酪氨酸酶是一种含铜的多酚氧化酶,广泛应用于食品、日化、医药等领域。目前商品化酪氨酸酶主要依赖于真菌提取,存在价格高、纯度低、比酶活低和稳定性差等问题。本研究旨在获得高效表达并具有工业化应用前景的细菌酪氨酸酶。通过在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达5种不同来源的细菌酪氨酸酶,筛选获得了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)来源的酪氨酸酶TyrBm和TyrVs,酶活分别为(16.1±0.2)U/mL和(48.6±0.9)U/mL。纯化后通过比较TyrBm与TyrVs的酶学性质,证明了TyrVs具有更高的热稳定性和底物专一性。在表征TyrVs高催化性能的基础上,建立了基于TyrVs催化的酶法生物染发体系,实现了原位催化染发,水洗色牢度实验测得模拟14 d清洁后的色差值∆E低于7.38±0.64。为便于催化产物与酶快速分离,成功构建了依赖于自组装标签CipA的固定化酶TyrVs-CipA催化体系并应用于水解丝素多肽(hydrolysed silk fibroin,HSF)的多巴修饰(DOPA modification),酶连续催化达7次以上,单次多巴修饰度超过70.00%。进一步研究表明,多巴修饰使HSF对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)自由基与O2-自由基清除活性分别提高了507.80%与78.23%。本研究为基于酪氨酸酶的绿色生物染发剂及组织工程生物材料开发提供了技术基础。 展开更多
关键词 细菌酪氨酸酶 固定化酶 生物染发剂 水解丝素 多巴修饰
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肝素硫酸转移酶优化表达及其在动物源肝素硫酸化中的应用 被引量：1
5
作者 周正雄 王兵兵 +3 位作者 胥睿睿 李青 堵国成 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期1784-1793,共10页
肝素是一种重要的凝血药物,目前主要依赖于动物小肠粘膜的提取。动物源肝素含有的抗凝血活性五糖单位GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S少,抗凝血活性低下。文中提出并验证了一种基于酶法催化动物源肝素,提高其硫酸化程度和抗凝血... 肝素是一种重要的凝血药物,目前主要依赖于动物小肠粘膜的提取。动物源肝素含有的抗凝血活性五糖单位GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S少,抗凝血活性低下。文中提出并验证了一种基于酶法催化动物源肝素,提高其硫酸化程度和抗凝血活性的方法。通过比较3种硫酸转移酶肝素-2-硫酸转移酶(Heparan sulfate-2-O-sulfotransferase,HS2ST)、肝素-6-硫酸转移酶(Heparan sulfate-6-O-sulfotransferase,HS6ST)、肝素-3-硫酸转移酶(Heparan sulfate-3-O-sulfotransferase,HS3ST)在重组大肠杆菌及重组毕赤酵母中表达,确定了毕赤酵母作为3种硫酸转移酶的表达宿主;进一步通过N端融合麦芽糖融合蛋白MBP和硫氧还蛋白Trx A,HS2ST和HS6ST的酶表达水平分别提高至(839?14) U/L和(792?23) U/L。通过3种硫酸转移酶HS2ST、HS6ST和HS3ST共同催化动物源肝素,其抗凝血活性由(76?2) IU/mg提高至(189?17) IU/mg。 展开更多
关键词 肝素 抗凝血活性 硫酸转移酶 毕赤酵母 异源表达
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基于工程化毕赤酵母一锅法合成硫酸软骨素A 被引量：8
6
作者 盛靖雨 金学荣 +2 位作者 胥睿睿 王阳 康振 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2594-2605,共12页
硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编... 硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种线性多糖,广泛应用于医疗和保健等领域。相比于传统动物组织提取法,微生物合成硫酸软骨素具有可控、易规模化放大等优势。为实现硫酸软骨素A(CSA)的高效合成,本研究首先通过整合软骨素合酶编码基因kfoC、kfoA以及UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD至毕赤酵母GS115基因组中,构建了以甘油为唯一碳源发酵生产软骨素的毕赤酵母工程菌株。通过进一步优化软骨素合成途径,软骨素分批补料发酵水平达到2.6 g/L。在进一步整合表达软骨素-4-O-磺基转移酶的基础上,本研究通过向生产软骨素毕赤酵母工程菌株破碎液中添加3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和软骨素-4-O-磺基转移酶,成功建立了CSA的一锅法生物合成体系。通过优化,最终实现0-40%不同磺酸化水平CSA的可控合成。本研究中CSA的一锅法生物合成体系操作简便、易放大,更适用于工业化大规模生产。本研究结果也为肝素等其他糖胺聚糖的合成提供了思路。 展开更多
关键词 软骨素 硫酸软骨素A 一锅法 3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸 毕赤酵母 生物合成体系
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