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贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立
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作者 罗声栋 卢姗姗 +5 位作者 胡燕 王涛 于永慧 冯乐 孙志会 宋立华 《生物技术通讯》 CAS 2016年第5期625-628,共4页
目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan^R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P... 目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan^R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan^R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果:构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论:建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。 展开更多
关键词 贝氏柯克斯体 Q热 穿梭载体 转化 RSF1010质粒
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HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的意义 被引量:12
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作者 卢姗姗 李晓东 +6 位作者 罗声栋 乔艳 许智慧 刘妍 李伯安 徐东平 李进 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期351-357,共7页
目的分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义。方法对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析。对1... 目的分析乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(MHR)新增N-糖基化突变的特点,探讨HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义。方法对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性的慢性HBV感染者S基因进行测序分析。对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者样本进行随访收集和研究。构建双N-糖基化突变和对照前S/S基因重组质粒,转染HepG2细胞,分析突变对病毒复制力和抗原性的影响。结果 HBsAg+抗HBs双阳性患者MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3%(32/284),显著高于HBsAg单阳性患者的2.9%(9/314)(P<0.01)。HBsAg+抗HBs双阳性组中,72例肝细胞癌(HCC)在N-糖基化突变阳性和阴性患者中所占比例分别为46.9%(15/32)和22.6%(57/252)(P<0.01)。从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0%、2.0%和2.5%,第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6%,但无s P120缺失+G145D联合突变。与野生株相比,新型突变株复制力提高31%,但HBsAg定量降低99%。免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,sP120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响。结论 HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg的抗原性。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 S基因 突变 N-糖基化 抗原性
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新型呼肠病毒S基因DNA疫苗在小鼠体内的免疫原性 被引量:1
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作者 侯俊 刘泽 +3 位作者 谢国明 罗声栋 李瑞生 白冰珂 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2014年第4期24-27,I0001,共5页
目的探讨新型呼肠病毒R4株S片段免疫小鼠后引发的免疫应答。方法构建4个不同S基因节段的重组真核表达质粒,并免疫小鼠;ELISA检测血清以研究R4特异性抗体升高水平,并对其抗体亚型进行鉴定;ELISPOT检测小鼠淋巴细胞INF-γ的表达情况。结... 目的探讨新型呼肠病毒R4株S片段免疫小鼠后引发的免疫应答。方法构建4个不同S基因节段的重组真核表达质粒,并免疫小鼠;ELISA检测血清以研究R4特异性抗体升高水平,并对其抗体亚型进行鉴定;ELISPOT检测小鼠淋巴细胞INF-γ的表达情况。结果与对照组相比,4个重组质粒免疫的小鼠血清都有明显的R4特异性抗体升高,尤其以S1和S3基因免疫后抗体水平较高,且均以IgG2a占绝对优势;S1基因免疫组小鼠的细胞免疫应答最强。结论 S1基因重组质粒免疫小鼠后可同时引发较强的体液免疫和细胞免疫应答,是较为理想的疫苗备选基因片段。 展开更多
关键词 呼肠病毒 DNA疫苗 体液免疫 细胞免疫 小鼠
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新型呼肠病毒M片段对核转录因子κB的活性抑制的研究
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作者 白冰珂 陶玲 +5 位作者 沈宏辉 侯俊 胡燕 罗声栋 杨锐创 貌盼勇 《传染病信息》 2013年第6期351-354,共4页
目的探讨新型呼肠病毒M片段能否抑制核转录因子-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的活性。方法构建3个不同中基因节段的重组真核表达质粒,并瞬时转染真核细胞,利用荧光素酶双报告系统检测其... 目的探讨新型呼肠病毒M片段能否抑制核转录因子-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的活性。方法构建3个不同中基因节段的重组真核表达质粒,并瞬时转染真核细胞,利用荧光素酶双报告系统检测其对NF-κB激活有抑制效应的基因。结果酶切鉴定3个基因重组质粒均构建成功。其中M3基因表达的蛋白对肿瘤坏死因子α介导的NF-κB激活有较明显的抑制,抑制率达55%。而M1和M2基因表达的蛋白较之于空载体均无明显的抑制效果。结论 M3基因能显著抑制肿瘤坏死因子α介导的NF-κB激活,为研究病毒的致病及免疫调控机制提供了重要理论依据。 展开更多
关键词 呼肠病毒科 质粒
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人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定 被引量:1
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作者 张敏娜 罗声栋 +1 位作者 胡燕 貌盼勇 《国际检验医学杂志》 CAS 2016年第9期1223-1225,共3页
目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流... 目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。 展开更多
关键词 人上皮细胞黏附分子 真核表达 载体
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贝氏柯克斯体类脂A修饰突变株的转化与鉴定
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作者 王涛 王权 +3 位作者 罗声栋 张爱民 李文刚 段学章 《传染病信息》 2024年第5期455-458,475,共5页
目的基于遗传克隆后的电转化技术,探索构建贝氏柯克斯体脂多糖修饰突变的实验室研究模型。方法设计并分子克隆引入衣原体KDO基因构建穿梭质粒,电转化贝氏柯克斯体后以半固体无生命培养克隆纯化并扩大培养,进一步用相差显微镜观察抑制剂L... 目的基于遗传克隆后的电转化技术,探索构建贝氏柯克斯体脂多糖修饰突变的实验室研究模型。方法设计并分子克隆引入衣原体KDO基因构建穿梭质粒,电转化贝氏柯克斯体后以半固体无生命培养克隆纯化并扩大培养,进一步用相差显微镜观察抑制剂LPC-011对贝氏柯克斯体的影响,利用qPCR定量对比测定转化突变与野生株在细胞或无细胞条件下的生长曲线并在Vero细胞中测得感染性集落形成单位。结果载体pCBGkdtA可稳定转化贝氏柯克斯体,LPC-011对贝氏柯克斯体最小抑菌浓度可能大于10μg/mL,类脂A修饰后的贝氏柯克斯体生长繁殖特性较野生型无显著改变。结论成功构建了贝氏柯克斯体类脂A修饰株CBkdtA并对其生长繁殖与感染特性进行了鉴定,本研究为进一步在动物模型中探究脂多糖的致病机理提供了新方法。 展开更多
关键词 贝氏柯克斯体 脂多糖 类脂A 电转化 遗传
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沙眼衣原体CT135蛋白的表达与抗体制备 被引量:1
7
作者 孙志会 罗声栋 +3 位作者 何泽民 胡燕 宋立华 王景林 《生物技术通讯》 CAS 2020年第1期19-23,共5页
目的:在原核表达系统中表达沙眼衣原体CT135蛋白,并制备抗体,建立CT135蛋白免疫检测方法。方法:将沙眼衣原体CT135基因(1083 bp)克隆入带有His标签的pET-32a(+)载体中,通过NdeⅠ/XhoⅠ双酶切构建CT135全长的重组质粒WT,CT135基因N端逐... 目的:在原核表达系统中表达沙眼衣原体CT135蛋白,并制备抗体,建立CT135蛋白免疫检测方法。方法:将沙眼衣原体CT135基因(1083 bp)克隆入带有His标签的pET-32a(+)载体中,通过NdeⅠ/XhoⅠ双酶切构建CT135全长的重组质粒WT,CT135基因N端逐渐缩短的重组质粒MT1、MT2、MT3,以及CT135基因C端逐渐缩短的重组质粒MT4、MT5、MT6,在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,然后腹腔注射5周龄BALB/c雌鼠制备抗血清。结果:Western印迹使用高灵敏的二抗通过红外扫描系统检测到所有质粒可表达重组蛋白,但考马斯亮蓝染色结果显示只有MT6可高表达重组蛋白。制备纯化了MT6重组蛋白,通过腹腔注射免疫法制备了小鼠抗MT6血清。结论:大肠杆菌表达系统中,沙眼衣原体CT135蛋白的N端片段(1~374 bp)可以获得高表达。小鼠抗MT6血清的制备为后期检测沙眼衣原体CT135蛋白的表达奠定了基础。 展开更多
关键词 沙眼衣原体 CT135基因 蛋白表达
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贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体的克隆与鉴定
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作者 何泽民 孙志会 +5 位作者 于永慧 罗声栋 王益清 王景林 姜永强 宋立华 《生物技术通讯》 CAS 2019年第2期170-174,共5页
目的:克隆分离国内贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体,并利用基因组测序方法进行鉴定,为贝氏柯克斯体研究提供参考依据。方法:用半固体平板法克隆分离贝氏柯克斯体,对随机选择的克隆株CB01进行全基因组测序分析,将测序结果与国外贝氏柯克斯... 目的:克隆分离国内贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体,并利用基因组测序方法进行鉴定,为贝氏柯克斯体研究提供参考依据。方法:用半固体平板法克隆分离贝氏柯克斯体,对随机选择的克隆株CB01进行全基因组测序分析,将测序结果与国外贝氏柯克斯体不同克隆株的基因组进行比较分析。结果:CB01的基因组全长2.024 Mb,包含1个1.987 Mb的环状染色体和1个37.321 kb的质粒。与九里株Ⅰ相菌(RSA 493克隆)基因组相比,CB01多出5个重复序列,有1个25 997 bp的删除区,23个单核苷酸多态性位点(SNP)差异。与九里株Ⅱ相菌(RSA 439克隆)基因组相比,CB01同样多出5个重复序列,但仅有6个SNP差异。CB01与RSA 439的CBU_0533基因序列完全相同,可解释CB01缺失O抗原从而成为Ⅱ相菌。结论:贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相菌克隆CB01与国外Ⅱ相菌RSA 439高度同源,CB01可用做国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。 展开更多
关键词 贝氏柯克斯体 Q热 全基因组测序 适应性变异
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新型肠道病毒89型结构蛋白VP1的构建表达及序列分析 被引量:1
9
作者 侯俊 白冰珂 +5 位作者 胡燕 沈宏辉 李瑞生 孙艳玲 罗声栋 貌盼勇 《中国医药导报》 CAS 2013年第34期4-6,13,共4页
目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白,并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH-VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性。将EV89 VP1... 目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白,并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH-VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性。将EV89 VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导7 h后可诱导表达得到约33 kD的蛋白,经Western Blot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性。分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与Genbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86.4%、85.9%、85.6%。结论成功构建EV89重组蛋白,其表达产物具有良好的特异性及活性,可进一步用于VP1检测方法的研制。进化分析表明,分离的EV89 VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远。 展开更多
关键词 肠道病毒89型 VP1蛋白 原核表达
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Q热性心内膜炎1例抗Ⅰ相和Ⅱ相抗原IgG抗体的跟踪监测报道 被引量:3
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作者 于永慧 王涛 +3 位作者 罗声栋 冯乐 孙志会 宋立华 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期160-160,F0003,共2页
Q热(query fever,Qfever,不明热)是由贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)感染人导致的一种无特征性病症的发热疾病,临床上与流感等不易区分,常被误诊漏诊。Cb为人畜共患的专性胞内寄生菌,在我国分布广泛,禽、畜等动物足其主要宿主... Q热(query fever,Qfever,不明热)是由贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)感染人导致的一种无特征性病症的发热疾病,临床上与流感等不易区分,常被误诊漏诊。Cb为人畜共患的专性胞内寄生菌,在我国分布广泛,禽、畜等动物足其主要宿主和传染源,Cb可引起孕畜流产,造成经济损失。人感染Cb后,除出现类似流感的不明发热症状以外, 展开更多
关键词 Q热 贝氏柯克斯体 心内膜炎 免疫球蛋白G
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新型呼肠病毒S1基因真核表达质粒的构建及表达 被引量:1
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作者 白冰珂 黄维芝 +6 位作者 罗声栋 胡燕 高蓉 王志杰 黄琼 柳昊东 貌盼勇 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期361-363,共3页
目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白盯1蛋白的真核表达质粒,研究其在真核细胞内的表达。方法将s1基因克隆人真核表达载体pCAGGS/MCS,构建真核表达质粒pc—s并转染~ero细胞。通过SDS—PAGE和Western—Blot试验,对转染后24,48及72h的... 目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白盯1蛋白的真核表达质粒,研究其在真核细胞内的表达。方法将s1基因克隆人真核表达载体pCAGGS/MCS,构建真核表达质粒pc—s并转染~ero细胞。通过SDS—PAGE和Western—Blot试验,对转染后24,48及72h的细胞内蛋白表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS—PAGE和Western—Blot的检测结果一致表明,转染后s1基因可在Vero细胞内表达且72h的细胞内蛋白表达量最高。结论通过构建重组真核表达质粒,可使s1基因在真核细胞内高效表达,为进一步研究新型呼肠病毒与宿主受体的相互作用打下基础。 展开更多
关键词 呼肠病毒科 基因表达调控 病毒 病毒蛋白质类
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青海藏区B型沙眼衣原体的分离培养与鉴定 被引量:1
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作者 鲁辛辛 冯乐 +6 位作者 于永慧 罗声栋 孙志会 王涛 端青 王宁利 宋立华 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期1444-1450,共7页
【目的】对青海藏区沙眼患者标本进行沙眼衣原体分离培养与鉴定。【方法】分别采集患者的单眼结膜和结膜囊拭子标本至1 mL样本保护培养基中。取50μL样本采用离心法感染BGM细胞,37°C培养72 h,连续传代3次,相差显微镜观察衣原体包... 【目的】对青海藏区沙眼患者标本进行沙眼衣原体分离培养与鉴定。【方法】分别采集患者的单眼结膜和结膜囊拭子标本至1 mL样本保护培养基中。取50μL样本采用离心法感染BGM细胞,37°C培养72 h,连续传代3次,相差显微镜观察衣原体包涵体。对临床样本和分离株分别进行主要外膜蛋白基因ompA序列分析。【结果】共采集了45例活动性沙眼患者的115份临床样本,其中54份样本为ompA PCR阳性,15份样本为沙眼衣原体培养阳性。ompA分析发现,青海藏区沙眼衣原体有3个不同的同源ompA变异株,均为基因B型,都包含有一个泌尿生殖道型沙眼衣原体特有密码子。分离株QH111L和QH111R分别来自编号111患者的左眼和右眼样本,它们ompA基因的可变区有一个非同义碱基差异。该碱基变异仅存在于111号患者的左眼样本中,说明QH111L可能是新出现的ompA突变体。【结论】青海藏区的眼型沙眼衣原体流行株为基因B型,至少存在3个不同的ompA变异株。从青海藏区分离培养了15株眼型沙眼衣原体,发现同一患者的左右眼样本中的沙眼衣原体有不同ompA。本研究为研制沙眼疫苗和诊断试剂奠定了基础,也将有助于理解沙眼的进化和传播。 展开更多
关键词 沙眼衣原体 沙眼 进化 OMPA
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肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定 被引量:1
13
作者 胡燕 白冰珂 +4 位作者 沈宏辉 侯俊 高蓉 罗声栋 貌盼勇 《实用预防医学》 CAS 2012年第11期1615-1617,共3页
目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的... 目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 VP1蛋白 原核表达
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携带肠道病毒71型VPl基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定
14
作者 刘泽 胡燕 +6 位作者 沈宏辉 蔡少平 白冰珂 高蓉 罗声栋 柴燕涛 貌盼勇 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期117-119,共3页
目的构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VPl基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71DNA疫苗的研发。方法利用DNA重组技术,构建表达EV71VPl蛋白的真核表达质粒VR.EV7lVPl,体外转染Vero细胞后检测目的蛋白体外表达和抗原性... 目的构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VPl基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71DNA疫苗的研发。方法利用DNA重组技术,构建表达EV71VPl蛋白的真核表达质粒VR.EV7lVPl,体外转染Vero细胞后检测目的蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027。结果酶切鉴定证实构建含EV7lVPl基因的重组质粒,体外表达目的蛋白具有较好的抗原性.并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论成功构建稳定携带肠道病毒71型VPl基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础。 展开更多
关键词 肠道病毒属 疫苗 DNA 沙门菌 伤寒
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T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定
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作者 沈宏辉 白冰珂 +7 位作者 柳昊东 罗声栋 胡燕 侯俊 王志杰 孔维 鲍一丹 貌盼勇 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期146-148,共3页
目的建立TTRNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统。方法利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的基因,构建TTRNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞... 目的建立TTRNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统。方法利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的基因,构建TTRNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原。结果酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT.PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原。结论此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究。 展开更多
关键词 DNA指导的RNA聚合酶 肠道病毒属 转染
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新型呼肠病毒S1基因的表达鉴定
16
作者 白冰珂 胡燕 +6 位作者 侯俊 沈宏辉 陆日北 罗声栋 黄维芝 柴艳涛 貌盼勇 《实用预防医学》 CAS 2012年第11期1609-1611,1759,共4页
目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在... 目的构建新型呼肠病毒主要抗原蛋白的编码基因S1的重组原核表达质粒,对其在原核细胞内的表达进行研究。方法将S1基因克隆入原核表达载体pProEX HTa,构建重组原核表达载体pPLS,通过IPTG诱导,利用蛋白电泳和蛋白免疫印迹等方法对其在大肠杆菌中的表达进行研究。结果酶切分析表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western-blot的检测结果一致表明,诱导后1-5h均可检测到目的蛋白的表达,其中以5h的蛋白表达量最大,且表达的目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在。结论通过构建重组原核表达质粒,可使目的蛋白σ1得到诱导表达,为后续抗体制备及研究病毒一宿主相互作用提供实验基础。 展开更多
关键词 新型呼肠病毒 S1基因 σ1蛋白 重组原核表达质粒
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甲型流感病毒感染老年小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子变化与精氨酸代谢的相关性研究
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作者 周娟娟 刘诗洋 +6 位作者 李雪 杨欣欣 杨俊连 罗声栋 陈威巍 许文 王福生 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2024年第4期422-431,共10页
目的探究精氨酸代谢在甲型流感病毒(influenza A virus,FluA)感染引起的炎症反应中的作用。方法采用FluA滴鼻感染18月龄老年小鼠,于感染后第6天采集肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。采用Luminex多因子检... 目的探究精氨酸代谢在甲型流感病毒(influenza A virus,FluA)感染引起的炎症反应中的作用。方法采用FluA滴鼻感染18月龄老年小鼠,于感染后第6天采集肺组织和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。采用Luminex多因子检测法分析BALF中细胞因子水平,采用靶向代谢组学的方法分析BALF中代谢物的变化情况,并对细胞因子与代谢物之间的相关性进行分析。以FluA感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的剂量感染巨噬细胞,并加入不同浓度的精氨酸培养24 h。分别采用实时荧光定量RT-PCR法(real time fluorescence quantitative RT-PCR,qRT-PCR)和流式微球技术(cytometric bead array,CBA)检测白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和IL-10的mRNA和蛋白表达量。结果与对照组相比,FluA感染组老年小鼠BALF中肺表面活性蛋白D(surfactant protein D,SP-D)、TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、IL-1α、IL-6、IL-10、S100钙结合蛋白(recombinant S100 calcium binding protein,S100)A9、干扰素诱导蛋白10(interferon inducible protein 10,IP-10)、巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP9)、补体因子D的水平显著升高,精氨酸代谢通路中精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、肌酸和肌氨酸水平上调,且大部分升高的细胞因子水平与精氨酸相关代谢物呈显著正相关。FluA感染后加入精氨酸可以使巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平显著降低,而IL-10的水平升高。结论精氨酸可以降低FluA感染诱导的巨噬细胞炎症反应,提示其可能成为FluA感染引起的肺部重症炎症的潜在干预靶点。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 支气管肺泡灌洗液 细胞因子 精氨酸代谢
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肠道病毒71型(EV71)AH3株感染性克隆的构建与鉴定
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作者 侯俊 李瑞生 +7 位作者 胡燕 罗声栋 白冰珂 沈宏辉 王志杰 柴燕涛 杨瑞创 貌盼勇 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2014年第1期58-60,共3页
目的 构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71) AH3株的全基因序列感染性克隆.方法 通过分段扩增和酶切连接将EV71全基因组cDNA片段逐步克隆入PWSK29载体,构建含全病毒基因组序列的重组质粒.转染Vero细胞后,获得拯救病毒.经RT-PCR、酶... 目的 构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71) AH3株的全基因序列感染性克隆.方法 通过分段扩增和酶切连接将EV71全基因组cDNA片段逐步克隆入PWSK29载体,构建含全病毒基因组序列的重组质粒.转染Vero细胞后,获得拯救病毒.经RT-PCR、酶切、测序、间接免疫荧光(IFA)等方法进行鉴定.结果 酶切鉴定结果与预期一致,序列分析显示为EV71基因;其转染Vero细胞后,可观察到典型的细胞病变;所获得的拯救子代病毒滴度(TCID50)为107.5;IFA检测可见感染细胞出现绿色荧光.结论 成功构建EV71全基因序列感染性克隆,为病毒致病机理及减毒疫苗的研究奠定基础. 展开更多
关键词 肠道病毒属 克隆 分子 拯救激活
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