6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶 被引量：4

1

作者 史耕先 马凤蓉 +4 位作者 朱立平 张立新 赵方萄 刘音 王讯 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第6期439-443,共5页

目的　探讨6A8cDNA编码的蛋白质的性质。方法　依据ConA的配体是甘露糖,而α-甘露糖苷酶的作用是修剪细胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染6A8cDNA正义或反义重组表达载体后,细胞结合Con... 目的　探讨6A8cDNA编码的蛋白质的性质。方法　依据ConA的配体是甘露糖,而α-甘露糖苷酶的作用是修剪细胞糖蛋白聚糖中甘露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染6A8cDNA正义或反义重组表达载体后,细胞结合ConA的强弱,验证6A8cDNA编码的蛋白质是否为一种α-甘露糖苷酶。结果　COS-7细胞和人鼻咽癌细胞株CNE-2L2转染pRc/CMV-正义6A8cDNA后与ConA结合减弱,而与单抗6A8染色增强;CNE-2L2细胞转染pRc/CMV-反义6A8cDNA后,与ConA结合增强,而与单抗6A8染色减弱。结论　6A8cDNA编码的蛋白质可能为一种α-甘露糖苷酶,它可被单抗6A8识别。 展开更多

关键词 6A8cDNA α-甘露糖苷酶 ConA结合

在线阅读 下载PDF 职称材料

口服耐受的机制及其在自身免疫病治疗中的应用 被引量：1

2

作者 史耕先 朱立平 《基础医学与临床》 CSCD 1998年第4期8-12,共5页

口服耐受是指口服蛋白引起的一种免疫低反应状态。自Ｗｅｌ１ｓｌ９１１年首先报道这种现象以来，口服耐受引起了广泛关注，大量研究者发现给动物饲服蛋白质或绵羊红细胞后，再次消化道外免疫时，动物对这些抗原不再具有良好的反应性，... 口服耐受是指口服蛋白引起的一种免疫低反应状态。自Ｗｅｌ１ｓｌ９１１年首先报道这种现象以来，口服耐受引起了广泛关注，大量研究者发现给动物饲服蛋白质或绵羊红细胞后，再次消化道外免疫时，动物对这些抗原不再具有良好的反应性，而对其它抗原的反应正常［１］。免疫... 展开更多

关键词 自身免疫病 药物疗法 口服耐受

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶酶解p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside 被引量：5

3

作者 王壮志 李琳 +3 位作者 史耕先 刘音 赵方萄 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期423-427,共5页

目的明确6A8cDNA编码蛋白质的α-甘露糖苷酶性质。方法利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8cDNA将其插入到真核表达载体pCDI转染COS-7细胞,用酶活性检测与Westernblot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果拼接后... 目的明确6A8cDNA编码蛋白质的α-甘露糖苷酶性质。方法利用基因重组技术将克隆到的3个DNA片段拼接成完整6A8cDNA将其插入到真核表达载体pCDI转染COS-7细胞,用酶活性检测与Westernblot对瞬时表达的蛋白质的性质进行鉴定。结果拼接后的cDNA片段经测序完全符合6A8cDNA碱基顺序。转染重组表达载体pCDI-6A8的COS-7细胞的匀浆对p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside的酶解作用为转染空载体pCDI的细胞及野生型细胞的3～4倍,且这种酶解作用不能被swainsonine所抑制。Westernblot检测显示在相对分子质量(Mr)120000处有一明显蛋白带,此带的显影于转染pCDI-6A8cDNA的细胞明显深于转染空载pCDI及野生型细胞。结论6A8cDNA编码的蛋白质确为一种α-甘露糖苷酶,属于Ⅱ类α-甘露糖苷酶。 展开更多

关键词 6A8 α-甘露糖苷酶 COS-7细胞 瞬时表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE-2L2生长抑制 被引量：3

4

作者 岳玮 史耕先 +1 位作者 白增亮 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期418-422,共5页

目的研究6A8α-甘露糖苷酶与CNE-2L2肿瘤细胞生长的关系。方法用腺相关病毒载体将反义6A8cDNA导入鼻咽癌细胞CNE-2L2。细胞中6A8α-甘露糖苷酶表达情况用单抗6A8a免疫荧光染色、α-甘露糖苷酶活性及ConA结合试验检测。以野生型细胞、转... 目的研究6A8α-甘露糖苷酶与CNE-2L2肿瘤细胞生长的关系。方法用腺相关病毒载体将反义6A8cDNA导入鼻咽癌细胞CNE-2L2。细胞中6A8α-甘露糖苷酶表达情况用单抗6A8a免疫荧光染色、α-甘露糖苷酶活性及ConA结合试验检测。以野生型细胞、转导了空载体或正义6A8的细胞作对照,以MTT、集落形成及裸鼠实验检测肿瘤细胞生长。结果转导反义6A8能抑制CNE-2L2细胞6A8α-甘露糖苷酶表达,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞的MTT值、形成集落数及接种裸鼠皮下后所长肿瘤的重量均较对照显著降低或减小P<0.001。结论6A8α-甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE-2L2生长抑制。 展开更多

关键词 6A8 α-甘露糖苷酶 CNE-2L2细胞 肿瘤生长 鼻咽癌

在线阅读 下载PDF 职称材料

转导反向6A8α-甘露糖苷酶cDNA对抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡的影响 被引量：3

5

作者 岳玮 史耕先 +2 位作者 王壮志 刘音 朱立平 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2001年第2期136-140,共5页

用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究人T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA后 ,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化 ,并用间接免疫荧光染色 (流式细胞仪 )检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明 ,抗Fas抗体诱导细胞... 用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究人T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA后 ,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化 ,并用间接免疫荧光染色 (流式细胞仪 )检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明 ,抗Fas抗体诱导细胞 2 4h后 ,野生型及转导空载载体的Jurkat细胞出现明显的梯形DNA ,两者之间无明显差异 ,但转导反向 6A8cDNA的细胞未见明显的梯形DNA。Gimsa染色结果显示转导反向 6A8cDNA的Ju rkat细胞中凋亡细胞数明显减少 ,而转导空载载体则无影响。Jurkat细胞为Fas(CD95 ,Apo 1)全阳性细胞 ,转导反向 6A8cDNA或空载载体对Fas表达阳性率与Fas表达强度无明显影响。以上结果提示 ,转导编码 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA使人T细胞株Jurkat对抗人Fas抗体诱导的凋亡作用产生耐受。 展开更多

关键词 细胞凋亡 反向6A8cDNA 反向6A8α-甘露糖苷酶 抗Fas抗体 JURKAT细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶表达抑制致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少 被引量：1

6

作者 岳玮 赵方萄 +2 位作者 史耕先 刘音 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期316-319,共4页

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L... 目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L枸橼酸钠/50%乙醇溶解结合到细胞中的染料。测定540nm处的吸光度值(AT),按R=AT/A100×100%计算粘附率(A100为100%粘附值)。扫描电镜观察细胞表面的片状伪足。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的2个克隆细胞株(AS1和AS2)对层粘连蛋白的相对粘附率分别为0.447±0.096与0.533±0.065,而6A8α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞(W、M和S)的相对粘附率分别为0.78±0.035、0.7±0.05和0.80±0.04。两者的差别有生物学意义(P<0.01)。6A8α-甘露糖苷酶表达正常的细胞表面片状伪足丰富,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞表面的片状伪足基本上消失。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制可导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少。 展开更多

关键词 6A8 α-甘露糖苷酶 粘附性 片状伪足

在线阅读 下载PDF 职称材料

一个人类α-甘露糖苷酶全长cDNA的分子克隆 被引量：1

7

作者 李波 马凤蓉 +6 位作者 史耕先 赵方萄 李景 李琳 汪燚 蔡有余 朱立平 《基础医学与临床》 CSCD 1999年第5期25-31,共7页

用我们以往克隆到的1358bp6A8cDNA片段作探针，籍southernblot从一个人扁桃体细胞λgtllCDNA文库筛选，再用RACE方法，克隆到了一个长3300bp的6A8全长CDNA。此CDNA内有一长3188hp（57～3245hp）的开放阅读框架，编码1064个氨基酸的蛋白... 用我们以往克隆到的1358bp6A8cDNA片段作探针，籍southernblot从一个人扁桃体细胞λgtllCDNA文库筛选，再用RACE方法，克隆到了一个长3300bp的6A8全长CDNA。此CDNA内有一长3188hp（57～3245hp）的开放阅读框架，编码1064个氨基酸的蛋白质。此蛋白质的氨基酸序列与大鼠一个ER－α－甘露糖苦酶（1040个氨基酸）的相同性和相似性高达78％和82％，与一个酵母－α－甘露糖着酶（1083个氨基酸）的相同性和相似性亦达33％和47％。另外，值得注意的是其260～432位氨基酸序列与人类、猪、大鼠和小鼠的多种α－甘露糖甘醇的相应氨基酸序列的相同性均高于20％，提示这段保守序列与α－甘露糖着酶的功能可能有关。 展开更多

关键词 CDNA克隆 序列分析 α-甘露糖苷酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

潘生丁增强抗代谢药物抗肿瘤作用的研究进展 被引量：1

8

作者 史耕先 李嗣英 《国外医学（肿瘤学分册）》 北大核心 1992年第5期267-270,共4页

本文综述了潘生丁通过抑制核苷转运而阻断核苷补救途径、影响抗代谢药物的代谢以及增强抗代谢药物抗肿瘤作用研究进展情况,并介绍了潘生丁与抗代谢药联合应用的临床试验效果。

关键词 哌醇啶 抗代谢药 肿瘤

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶表达减弱抑制鼻咽癌细胞CNE-2L2转移的分子机制

9

作者 岳玮 詹少兵 +4 位作者 高阳 史耕先 刘音 赵方萄 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期655-658,共4页

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadheri... 目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对鼻咽癌细胞CNE-2L2间粘附性、细胞表达E-cadherin及对细胞接种裸鼠皮下所生长肿瘤肺转移的影响。方法软琼脂培养观察非锚定状态下细胞间的粘附;间接免疫荧光染色、免疫组化染色及RT-PCR检测E-cadherin的表达;CNE-2L2细胞接种裸鼠皮下,8周后病理切片检测所长肿瘤肺转移程度。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的CNE-2L2细胞(AS)在非锚定状态下发生粘附,此粘附对Ca2+有依赖性。野生型CNE-2L2细胞弱表达E-cadherin,但AS细胞的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin表达增强既见于蛋白质水平,也见于mRNA水平。AS细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制使CNE-2L2细胞间的粘附性增强,细胞表面E-cadherin表达增强,细胞接种裸鼠皮下所长肿瘤的肺转移明显受抑。 展开更多

关键词 鼻咽癌 6A8 α-甘露糖苷酶 E-CADHERIN 肿瘤转移

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶表达对人鼻咽癌细胞CNE-2L2端粒酶活性和端粒长度的影响

10

作者 靳玉兰 赵方萄 +3 位作者 岳玮 史耕先 刘音 朱立平 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2003年第3期283-286,共4页

探讨端粒长度与端粒酶活性在人鼻咽癌细胞CNE 2L2恶性行为改变前后的变化 ,建立研究恶性行为改变与端粒长度与端粒酶活性间关系的细胞模型。与 6A8α 甘露糖苷酶表达正常的CNE 2L2细胞 (野生型细胞W ,转导空载体的细胞M及转导无关DNA片... 探讨端粒长度与端粒酶活性在人鼻咽癌细胞CNE 2L2恶性行为改变前后的变化 ,建立研究恶性行为改变与端粒长度与端粒酶活性间关系的细胞模型。与 6A8α 甘露糖苷酶表达正常的CNE 2L2细胞 (野生型细胞W ,转导空载体的细胞M及转导无关DNA片段的细胞S)相比 ,6A8α 甘露糖苷酶表达低下的细胞 (AS)接种裸鼠皮下后的肿瘤性生长受抑。用TeloTAGGGTelomereLengthAssayKit及TelomerasePCRELISAKit分别测定端粒长度及端粒酶活性 ,用RT PCR方法分析端粒重复序列结合因子 (TRF)的转录水平。见AS细胞的端粒明显缩短 (6 78Kb ,W细胞为8 4 0Kb ,M细胞为 8 34kb ,S细胞为 9 5 6kb) ,但端粒酶活性及端粒重复序列结合因子 1和 2 (TRF 1和 2 )的转录水平未见改变。实验表明 ,恶性行为降低的CNE 2L2细胞的端粒变短 ,但与端粒酶活性及TRF 1 2无关 ,提示在CNE 2L2细胞中可能存在着端粒酶及TRF 1 2以外的调节端粒长度的机制。 展开更多

关键词 鼻咽癌 6A8α-甘露糖苷酶 基因表达 CNE-2L2 端粒酶 端粒长度 端粒重复序列结合因子

在线阅读 下载PDF 职称材料

6A8α-甘露糖苷酶表达对人B淋巴细胞3D5增殖反应的影响

11

作者 赵方萄 史耕先 +1 位作者 李琳 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期529-532,共4页

目的观察 6A8α-甘露糖苷酶表达对人 B细胞株 3D5增殖反应的影响。方法以重组腺相关病毒颗粒为载体，将正义 6A8 DNA或反义 6A8 DNA转导入 EB病毒转化的人 B细胞株 3D5，用单抗 6A8a染色反应和 Con A结合试验确认 6A8α-甘露糖苷酶高表... 目的观察 6A8α-甘露糖苷酶表达对人 B细胞株 3D5增殖反应的影响。方法以重组腺相关病毒颗粒为载体，将正义 6A8 DNA或反义 6A8 DNA转导入 EB病毒转化的人 B细胞株 3D5，用单抗 6A8a染色反应和 Con A结合试验确认 6A8α-甘露糖苷酶高表达和低表达。以野生型细胞及转导空载载体的细胞作对照， MTT法检测细胞对 B细胞生长因子（ BCGF）、葡萄球菌 Cowen I（ SAC）或 IL- 6刺激的增殖反应。结果转导正义 6A8 DNA的细胞高表达 6A8α-甘露糖苷酶，转导反义 6A8 DNA的细胞低表达 6A8α-甘露糖苷酶。转导正义 6A8 DNA的 3D5细胞在 SAC诱导下的增殖反应明显增强（ P< 0.05），但转导反义 6A8 DNA细胞的增殖反应无变化。对低分子量 BCGF或 IL- 6诱导的刺激，转导正义 6A8或反义 6A8对细胞的增殖反应均无影响。结论 6A8α-甘露糖苷酶活性增高使 3D5细胞对 SAC刺激的增殖反应增强。 6A8α-甘露糖苷酶活性变化对低相对分子质量 BCGF或 IL- 6诱导的增殖反应无影响。 展开更多

关键词 6A8 α-甘露糖苷酶 3D5 B细胞 增殖反应

在线阅读 下载PDF 职称材料

ER α-甘露糖苷酶表达降低引起大鼠肝脏上皮细胞微绒毛减少变短

12

作者 赵方萄 李瞡 +2 位作者 史耕先 刘音 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期52-55,共4页

目的观察蛋白质糖基化改变对大鼠肝脏上皮细胞WB-F344表面微绒毛及在培养中生长的影响。方法构建含正义或反义6A8DNA的重组pAGX(+)质粒,用脂质体法将重组质粒或空载质粒转染WB-F344细胞,作G418筛选,以有限稀释法作细胞克隆,进行PCR检测... 目的观察蛋白质糖基化改变对大鼠肝脏上皮细胞WB-F344表面微绒毛及在培养中生长的影响。方法构建含正义或反义6A8DNA的重组pAGX(+)质粒,用脂质体法将重组质粒或空载质粒转染WB-F344细胞,作G418筛选,以有限稀释法作细胞克隆,进行PCR检测新霉素抗性(neoR)基因以确定转染DNA在细胞基因组中的整合;用P-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside作底物检测细胞匀浆上清中ERα-甘露糖苷酶的活性;采用扫描电镜观察细胞表面的微绒毛,并做生长曲线检测。结果转染反义6A8的各WB-F344克隆细胞株的匀浆上清中,ERα-甘露糖苷酶活性有不同程度降低,其中以克隆AS1与AS2的降低最明显。克隆AS1与ConA结合增强,表面微绒毛减少、变短,细胞增殖减慢。结论大鼠肝脏ERα-甘露糖苷酶表达抑制所致的蛋白质糖基化改变,可导致大鼠肝脏上皮细胞WB-F344微绒毛减少、变短,细胞生长速度减慢。 展开更多

关键词 糖基化 微绒毛α-甘露糖苷酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

胞膜(Ecto)-6A8α-甘露糖苷酶

13

作者 朱立平 王壮志 +3 位作者 史耕先 刘音 王汛 赵方萄 《医学研究通讯》 2003年第12期6-8,共3页

68Aα-甘露糖苷酶是本实验室克隆的cDNA(GenBank的登记号为AF044414)编码的一个新的人α-甘露糖苷酶[1].该cDNA长3300bp,其开放阅读框架编码1062个氨基酸的蛋白质.蛋白质的1028～1048aa为穿膜区.6A8α-甘露糖苷酶属工型穿膜蛋白.6A8基... 68Aα-甘露糖苷酶是本实验室克隆的cDNA(GenBank的登记号为AF044414)编码的一个新的人α-甘露糖苷酶[1].该cDNA长3300bp,其开放阅读框架编码1062个氨基酸的蛋白质.蛋白质的1028～1048aa为穿膜区.6A8α-甘露糖苷酶属工型穿膜蛋白.6A8基因定位于第15号染色体q11～13区. 展开更多

关键词 胞膜-6A8α-甘露糖苷酶 单克隆抗体 免疫细胞胞膜 糖基化

在线阅读 下载PDF 职称材料

编码人白细胞分化抗原5D4的基因表达 被引量：1

14

作者 汪焱 马凤蓉 +4 位作者 孟晓燕 史耕先 刘音 赵方萄 朱立平 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期517-520,共4页

目的确证 5D4 cDNA是全长 cDNA，并为制备抗 5D4不同表位的单克隆抗体准备抗原。方法构建重组表达质粒 pGEX- 5X- 3- 5D4全长和 pGEX- 5X- 3- 5D4 5′侧 ,并转化大肠杆菌 DH5α ,使其表达 5D4分化抗原，用 Northern印迹分析和 RT- PCR检... 目的确证 5D4 cDNA是全长 cDNA，并为制备抗 5D4不同表位的单克隆抗体准备抗原。方法构建重组表达质粒 pGEX- 5X- 3- 5D4全长和 pGEX- 5X- 3- 5D4 5′侧 ,并转化大肠杆菌 DH5α ,使其表达 5D4分化抗原，用 Northern印迹分析和 RT- PCR检测 5D4 mRNA在不同组织和免疫细胞株中的表达状况。结果 5D4 mRNA有 5种转录本，它们在不同组织有不同的表达， 1.9 kb RNA在所检测的 8种组织中只见于小肠组织和脾脏。 5D4 mRNA在不同免疫细胞的表达量不同。在大肠杆菌 DH5α中表达出了相对分子质量约为 66 000和 60 000的 5D4- GST融合蛋白。结论 1 846 bp 5D4 cDNA为全长 cDNA，并在大肠杆菌 DH5α中成功表达出了与 GST融合的 5D4分化抗原全长 (66 000)及其跨膜区侧氨基端蛋白质 (60 000)。 展开更多

关键词 分化抗原5D4 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

人分化抗原5C5在原核细胞的表达 被引量：1

15

作者 孟晓燕 汪燚 +3 位作者 马凤蓉 史耕先 赵方萄 朱立平 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2001年第3期218-221,共4页

为了确证 5C5cDNA是全长cDNA并制备抗 5C5分化抗原不同表位的功能性单抗 ,进而研究 5C5分化抗原的结构与功能 ,用Northern blot检测 5C5mRNA在人各种组织的表达 ,并构建了重组表达质粒pGEX 5X 3 5C5全长和pGEX 5X 3 5C5N端与pGEX 5X 3 5... 为了确证 5C5cDNA是全长cDNA并制备抗 5C5分化抗原不同表位的功能性单抗 ,进而研究 5C5分化抗原的结构与功能 ,用Northern blot检测 5C5mRNA在人各种组织的表达 ,并构建了重组表达质粒pGEX 5X 3 5C5全长和pGEX 5X 3 5C5N端与pGEX 5X 3 5C5C端。结果表明 :所有检测的组织中均只有一个 5C5mRNA转录本 ,其大小与 5C5cDNA长度一致 ,表明所分离到的 90 8bp 5C5cDNA是个全长cDNA。重组表达质粒pGEX 5X 3 5C5N端与pGEX 5X 3 5C5C端在大肠杆菌DH5α表达出了可溶性融合蛋白GST 5C5N端与GST 5C5C端 ,分子量各为 36kD和 35kD。 展开更多

关键词 分化抗原5C5 原核细胞表达 Northern印迹杂交

在线阅读 下载PDF 职称材料

BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡 被引量：4

16

作者 史耕先 刘音 +1 位作者 赵方萄 朱立平 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期480-485,共6页

目的　采用形态学和分子生物学方法 ,分析转导 6A8α 甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质。方法　用Giemsa染色、annexin Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法 ,分析细胞死亡的性质 ;应用ConA结合试验 ,检测... 目的　采用形态学和分子生物学方法 ,分析转导 6A8α 甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质。方法　用Giemsa染色、annexin Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法 ,分析细胞死亡的性质 ;应用ConA结合试验 ,检测转基因细胞 6A8α 甘露糖苷酶活性的改变 ;应用Fluo 3探针测定细胞胞浆 [Ca2 +]i。结果　用重组腺相关病毒 (rAAV)颗粒成功地将反义 6A8DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB。在克隆中 ,转导反义 6A8DNA的BJAB细胞在生长到 3～ 1 0个细胞时死亡 ,而野生型、转导空载或转导正义 6A8DNA的BJAB细胞生长良好。转导反义 6A8DNA的BJAB细胞呈聚集状生长 ,且有大量细胞肿胀 ,最终死亡。Giemsa染色光镜观察、an nexin Ⅴ荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明 ,这种死亡是一种oncosis(肿胀死 )样死亡。ConA结合试验表明 ,BJAB细胞在转导反义 6A8DNA后的结合率升高 ,而转导正义 6A8DNA后的结合率则下降。另外 ,转导反义 6A8DNA的细胞胞浆 [Ca2 +]i升高。结论　转导反义 6A8DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡 ,这种死亡可能与 6A8α 甘露糖苷酶表达被抑制有关。 展开更多

关键词 6A8α-甘露糖苷酶 反义6A8DNA BJAB细胞 Oncosis样死亡

原文传递

重组腺相关病毒转导外源基因入EB病毒转化的B淋巴细胞获长期表达 被引量：1

17

作者 史耕先 刘音 +1 位作者 李琳 朱立平 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期594-599,共6页

目的　采用重组腺相关病毒 (AAV)载体pAGX(+) ,把 6A8α 甘露糖苷酶基因的正义或反义DNA片段转导入EB病毒转化的B淋巴细胞 ,以获得正义或反义 6A8DNA长期表达的B淋巴细胞株。方法　构建含正义或反义 6A8DNA片段的重组pAGX(+)质粒。经包... 目的　采用重组腺相关病毒 (AAV)载体pAGX(+) ,把 6A8α 甘露糖苷酶基因的正义或反义DNA片段转导入EB病毒转化的B淋巴细胞 ,以获得正义或反义 6A8DNA长期表达的B淋巴细胞株。方法　构建含正义或反义 6A8DNA片段的重组pAGX(+)质粒。经包装后转导淋巴细胞 ,经G418筛选 ,用有限稀释法克隆转导成功的淋巴细胞。Northern杂交和RT PCR检测转导基因的mRNA表达水平。ConA结合试验检测细胞在转导基因后 6A8α 甘露糖苷酶活性的改变。结果　pAGX 反义6A8DNA及pAGX 正义 6A8DNA经包装获得了高复制滴度的重组AAV(rAAV)颗粒 ,藉助rAAV成功地把 6A8基因转导入EB病毒转化的B细胞株SKW6和B淋巴样白血病细胞株BJAB。Northern杂交结果显示 ,转导的正义或反义 6A8DNA获得表达。经 1年余传代培养 ,RT PCR检测见BJAB和SKW6细胞中转导的正义或反义 6A8DNA的mRNA表达增加 ,新霉素抗性基因 (neoR)也获得表达 ,表明转导基因获得了长期表达。ConA结合强度在转导反义 6A8DNA的细胞升高 ,提示转导反义 6A8DNA可影响 6A8α 甘露糖苷酶的表达。结论　用AAV载体成功地把 6A8α 甘露糖苷酶基因的正义或反义DNA片段转导入EB病毒转化的B淋巴细胞SKW6和B淋巴样白血病细胞株BJAB ,转导的基因获得长期表达 ,并干扰 6A8α 甘露糖苷酶的表达。 展开更多

关键词 重组腺相关病病毒 EB病毒转化 B淋巴细胞 外源基因 转导

原文传递

腺相关病毒载体pAGX(+)的构建 被引量：1

18

作者 史耕先 刘音 +1 位作者 赵方萄 朱立平 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期547-551,共5页

目的　构建腺相关病毒 (AAV)载体并进行鉴定 ,以介导真核细胞的基因传递和表达。方法　以基因重组技术构建AAV载体 ,用Southern杂交、狭缝杂交以及激光共聚焦显微镜等鉴定构建的AAV载体。结果　成功地获得了重组AAV表达载体pAGX( + ) ,... 目的　构建腺相关病毒 (AAV)载体并进行鉴定 ,以介导真核细胞的基因传递和表达。方法　以基因重组技术构建AAV载体 ,用Southern杂交、狭缝杂交以及激光共聚焦显微镜等鉴定构建的AAV载体。结果　成功地获得了重组AAV表达载体pAGX( + ) ,藉报告基因EYFP鉴定pAGX( + ) ,见pAEYFP经包装的重组AAV储存液的感染滴度达 1 .3 9× 1 0 7TU(transmissionunit) /ml、复制滴度达1 .94× 1 0 11颗粒 /ml。Southern杂交表明EYFP基因获得成功拯救。rAAV/EYFP颗粒成功转导COS 7细胞 ,EYFP获得表达 ,并整合入COS 7细胞基因组 ,而藉质粒载体pEYFPCMV介导的转移 ,EYFP未能整合。结论　成功地构建了一个AAV载体 ,并成功地介导了基因的转移、表达和整合。 展开更多

关键词 腺相关病毒载体 黄色荧光素蛋白EYFP 基因转移 基因表达

原文传递

SKW6细胞在转导6A8α-甘露糖苷酶反义cDNA后对抗Fas抗体诱导的凋亡

19

作者 史耕先 靳玉兰 +4 位作者 王壮志 崔巍 刘音 王讯 朱立平 《中国科学（C辑）》 CSCD 北大核心 2001年第3期259-265,共7页

鉴于蛋白质糖基化的重要生物学意义，以腺相关病毒为载体，把编码 ６Ａ８ α－ 甘露糖苷酶的ｃＤＮＡ ３’端１３５８ｂｐ的反向片段转导入ＥＢ病毒转化的Ｂ细胞株ＳＫＷ６， 探讨６Ａ８ α-甘露糖苷酶表达抑制对抗Ｆａｓ抗体诱导凋亡... 鉴于蛋白质糖基化的重要生物学意义，以腺相关病毒为载体，把编码 ６Ａ８ α－ 甘露糖苷酶的ｃＤＮＡ ３’端１３５８ｂｐ的反向片段转导入ＥＢ病毒转化的Ｂ细胞株ＳＫＷ６， 探讨６Ａ８ α-甘露糖苷酶表达抑制对抗Ｆａｓ抗体诱导凋亡的影响．反义６Ａ８转导成功及 表达用 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及ＲＴ－ＰＣＲ检测， ６Ａ８ α－甘露糖苷酶表达用 Ｃｏｎ Ａ结合试验检测． Ｇｉｅｍｓａ染色， Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色及梯形 ＤＮＡ电泳显示， Ｆａｓ抗体能诱导 ＳＫＷ６细胞凋亡，但 ６Ａ８ α－甘露糖苷酶表达抑制的细胞对Ｆａｓ抗体诱导的凋亡发生抵抗，而转导正义 ６Ａ８ 或空载载体则无影响． ６Ａ８ α－甘露糖苷酶表达状况对 ＳＫＷ６细胞表面 Ｆａｓ分子表达没有影响． 展开更多

关键词 细胞凋亡 反义6A8cDNA 6ABα-甘露糖苷酶 抗人Fas抗体 SKW6细胞

原文传递

编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探 被引量：3

20

作者 马凤蓉 阎民 +6 位作者 孟晓燕 赵方萄 汪燚 史耕先 刘音 王讯 朱立平 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期248-252,共5页

目的　编码 5C5分化抗原全长cDNA的克隆及功能探索。方法　构建人活化B细胞株3D5细胞的λgt11cDNA文库 ,以核苷酸杂交法从cDNA文库中筛选阳性克隆 ,作核苷酸序列分析 ,编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析 ,Northernblot测 5C5mRNA转录本... 目的　编码 5C5分化抗原全长cDNA的克隆及功能探索。方法　构建人活化B细胞株3D5细胞的λgt11cDNA文库 ,以核苷酸杂交法从cDNA文库中筛选阳性克隆 ,作核苷酸序列分析 ,编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析 ,Northernblot测 5C5mRNA转录本长度 ,用RT PCR检测 5C5mRNA在不同细胞株的表达 ,观察单抗 5C5 G1对 3D5细胞增殖的影响。结果　从人活化B细胞株 3D5的λgt11cDNA文库筛选到长 90 5bp的 5C5 1cDNA及 75 4bp的 5C5 2cDNA。 5C5 1cDNA序列内有 1个开放阅读框架 (19～ 5 37bp) ,编码 179个aa的蛋白质。此蛋白质内有一穿膜螺旋结构 (94～ 114aa) ,其N端在胞内。 5C5 2cDNA从 16 3到 45 9为开放阅读框架 ,编码 99个aa的蛋白质。从Northernblot见0 9kb左右和 0 7kb左右 2条杂交带。由RT PCR见 5C5mRNA在 3D5细胞强表达 ,在Daudi细胞表达次之 ,在Jurkat细胞表达最弱。单抗 5C5 G1有增强cpBCGF诱导 3D5细胞增殖的作用。结论　长90 5bp的 5C5 1cDNA为 1个全长cDNA。编码 1个膜蛋白 ,可能参与 3D5细胞的增殖反应。 展开更多

关键词 5C5 CDNA 亮氨酸拉链蛋白 B细胞 分化抗原

原文传递