羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价 被引量：8

1

作者 鲜思美 李鹏飞 +5 位作者 冯将 刘嫒 李婷 包细明 张益 张素辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期663-667,共5页

为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小... 为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小鼠的体液和细胞免疫反应。结果表明,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IL-2水平均显著高于pVAX1-B2L免疫组,与pVAX1和PBS对照组相比差异极显著(p<0.01)。而且pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L免疫组、空载体pVAX1组和PBS对照组(p<0.01)。因此,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫KM小鼠可以诱导特异性体液免疫和细胞免疫,并且IL-2具有免疫佐剂的作用,为进一步将其用于Orf的防制奠定了基础。 展开更多

关键词 OrfV B2L基因 IL-2 基因疫苗 联合免疫

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羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析 被引量：7

2

作者 李鹏飞 冯将 +4 位作者 刘嫒 包细明 张益 李婷 鲜思美 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1281-1288,共8页

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和... 旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 F1L基因 克隆 生物信息学分析

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携带DEV-gB/NP28重组减毒沙门氏菌诱导鸭的免疫应答研究 被引量：3

3

作者 鲜思美 李婷 +4 位作者 冯将 李鹏飞 包细明 张益 文明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期330-335,共6页

为探究表达鸭肠炎病毒(DEV)gB/NP28双基因重组减毒沙门菌口服疫苗在鸭体内诱导免疫应答能力,本研究将构建的重组菌(pcDNA3.1-DEV-gB/NP28)/SL7207、DVE弱毒疫苗、重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB/NP28及PBS分别免疫雏鸭,通过间接免疫荧光法检... 为探究表达鸭肠炎病毒(DEV)gB/NP28双基因重组减毒沙门菌口服疫苗在鸭体内诱导免疫应答能力,本研究将构建的重组菌(pcDNA3.1-DEV-gB/NP28)/SL7207、DVE弱毒疫苗、重组质粒pcDNA3.1-DEV-gB/NP28及PBS分别免疫雏鸭,通过间接免疫荧光法检测免疫鸭脾脏、胸腺、法氏囊、哈德氏腺组织中的抗原表达;双抗体夹心ELISA方法检测肠道黏膜sIgA;间接ELISA方法监测血清中DEV特异性抗体、外周血T淋巴细胞增殖及IFN-γ、IL-4细胞因子含量,对该口服疫苗进行免疫学评价。结果表明,重组菌能够诱导鸭产生良好的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答;攻毒试验显示,在DVE强毒攻击下重组菌免疫可提供75%以上的保护,表明重组菌免疫对DEV攻击具有一定的免疫保护作用。 展开更多

关键词 鸭病毒性肠炎病毒 GB基因 NP28基因 减毒沙门氏菌 免疫应答

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羊口疮病毒B2L、F1L基因融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究 被引量：3

4

作者 鲜思美 张友 +7 位作者 李婷 杨倩 饶体宇 吴伯梅 包涛涛 闵德省 包细明 张益 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期168-174,共7页

为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L... 为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。 展开更多

关键词 OrfV B2L基因 F1L基因 IL-2 融合表达 免疫应答

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羊口疮病毒大足株的分离鉴定 被引量：3

5

作者 李鹏飞 张友 +5 位作者 鲜思美 李婷 包细明 张益 饶体宇 吴伯梅 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第12期3725-3732,共8页

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒(orf virus,ORFV)流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞(LT),并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代... 本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒(orf virus,ORFV)流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞(LT),并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验(IFA)、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID 50测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%(11/18);大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%~100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID 50值为10-5.68/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。 展开更多

关键词 羊口疮病毒(ORFV) 分离鉴定 遗传进化分析

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牛粪与霉变玉米青贮混合堆肥试验研究 被引量：1

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作者 包细明 刘文凯 +3 位作者 熊海谦 卢华平 夏建友 周念 《湖北农业科学》 2021年第22期56-58,85,共4页

为对霉变玉米青贮进行资源化利用,缓解其对养殖环境带来的压力,采用条垛式堆肥方法,将牛粪与霉变玉米青贮混合,添加发酵菌种后进行堆肥发酵,探索其发酵效果。结果表明,与对照组相比,试验组能延长堆体高温期持续时间;堆肥最终pH为8.0~9.0... 为对霉变玉米青贮进行资源化利用,缓解其对养殖环境带来的压力,采用条垛式堆肥方法,将牛粪与霉变玉米青贮混合,添加发酵菌种后进行堆肥发酵,探索其发酵效果。结果表明,与对照组相比,试验组能延长堆体高温期持续时间;堆肥最终pH为8.0~9.0,且pH大小与物料的性质和不同成分的配比有一定的关系;总氮和铵态氮含量呈降低趋势,而总养分、P_(2)O_(5)和K_(2)O含量均呈不同程度升高的趋势;在堆肥末期,所有处理组均未能达到对白菜种子无毒的标准,这可能与物料pH以及霉变玉米青贮含有霉菌毒素有关。 展开更多

关键词 牛粪 霉变玉米青贮 混合堆肥

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鸭瘟病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用 被引量：5

7

作者 吴专伟 饶体宇 +6 位作者 鲜思美 彭庆波 张友 包细明 李婷 张益 吴伯梅 《中国家禽》 北大核心 2019年第12期17-21,共5页

为建立一种能同时鉴别鸭瘟病毒(DPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的双重PCR方法,根据DPV UL6基因和MDPV NS-VP1基因分别设计并合成两对特异性引物,通过对双重PCR反应的引物浓度和退火温度优化,建立了能快速检测DPV和MDPV的双重PCR方法,并对该... 为建立一种能同时鉴别鸭瘟病毒(DPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的双重PCR方法,根据DPV UL6基因和MDPV NS-VP1基因分别设计并合成两对特异性引物,通过对双重PCR反应的引物浓度和退火温度优化,建立了能快速检测DPV和MDPV的双重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。结果表明:设计的两对特异性引物均能扩增出目的条带,其大小分别约为376 bp和624 bp;优化引物浓度组合为:DPV引物1.0μmol/L,MDPV引物2.5μmol/L,最佳退火温度为52.4℃。DPV和MDPV的核酸最低检出量分别为4 pg和173 pg,建立的双重PCR分别对鹅细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭疫里默氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌、葡萄球菌、鸭源巴氏杆菌核酸扩增结果均呈阴性;对实验室保存的9份临床病料检测结果DPV检出率33.3%(3/9),MDPV检出率55.6%(5/9)。综上所述,建立的双重PCR方法特异性强、敏感性和稳定性较好,为DPV和MDPV的临床病料检测提供了技术支撑。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 番鸭细小病毒 双重PCR

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SOE-PCR技术在羊口疮病毒真核表达质粒构建中的应用 被引量：1

8

作者 钱林 李婷 +8 位作者 鲜思美 曹熠 张友 徐松平 陈元翠 张益 包细明 饶体宇 吴伯梅 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期95-98,共4页

为了构建羊口疮病毒B2L和F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L,探讨制备安全可靠羊口疮病毒核酸双基因疫苗的可行性,试验通过Primer Premier 5.0软件设计B2L和F1L融合基因2对引物,应用SOE-PCR技术将B2L和F1L连接起来,用限制性内切酶... 为了构建羊口疮病毒B2L和F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L,探讨制备安全可靠羊口疮病毒核酸双基因疫苗的可行性,试验通过Primer Premier 5.0软件设计B2L和F1L融合基因2对引物,应用SOE-PCR技术将B2L和F1L连接起来,用限制性内切酶消化后插入pVAX1真核表达载体中,构建B2L-F1L融合基因表达质粒,再转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,对真核表达质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定及序列测定。结果表明:利用SOE-PCR技术成功扩增出B2L-F1L融合基因;对真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L进行PCR鉴定和双酶切鉴定后,均可得到与预期大小一致的DNA片段;测序发现,真核表达质粒目的基因序列与预期设计一致。说明真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L构建成功。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 基因融合 SOE-PCR F1L基因 B2L基因 真核表达质粒

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花边鸭新城疫病毒与H9亚型禽流感病毒混合感染的诊断 被引量：2

9

作者 刘良林 张益 +8 位作者 鲜思美 杨纯培 王丽娟 吴伯梅 饶体宇 包细明 李婷 王现科 张友 《贵州畜牧兽医》 2019年第4期40-44,共5页

为确定贵州省三穗县某养鸭场花边鸭突发疫病的病因,通过流行病学调查、临床症状、病理变化、实验室检测,确诊为鸭源新城疫病毒与H9亚型禽流感病毒混合感染。

关键词 花边鸭 鸭源新城疫病毒 H9亚型禽流感病毒 混合感染 诊断

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一例引进鸭感染鸭瘟病毒的PCR检测诊断

10

作者 徐松平 张友 +6 位作者 鲜思美 饶体宇 李婷 张益 包细明 吴伯梅 彭庆波 《贵州畜牧兽医》 2019年第3期51-52,共2页

为诊断某养殖场新引进鸭死亡的病因,通过流行病学调查、临床症状、病理变化及病原核酸PCR检测,确诊为鸭瘟病毒感染。

关键词 鸭瘟检测 病理变化 PCR检测

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棚下牛粪养殖蚯蚓技术 被引量：3

11

作者 刘文凯 熊海谦 +3 位作者 包细明 殷怀辉 夏建友 周念 《湖北畜牧兽医》 2021年第7期25-27,共3页

对棚下牛粪养殖蚯蚓的具体技术进行了介绍,旨在解决牛粪对环境的污染并提高养牛经济效益,以期为养牛业解决实际问题。

关键词 牛粪 蚯蚓 养殖技术

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棚下牛粪养蚯蚓 除污提效废变宝

12

作者 刘文凯 熊海谦 +3 位作者 包细明 殷怀辉 夏建友 周念 《农业知识》 2023年第10期35-37,共3页

近年来,集约化、规模化养殖成为我国养牛业的主要发展方向。与传统的农户散养模式相比,规模化的养殖对养殖场周边环境及生态平衡带来很大的压力。不良的养殖环境会造成奶牛乳房炎、肢蹄病等健康问题,从而影响生产效益,而且随着国家环保... 近年来,集约化、规模化养殖成为我国养牛业的主要发展方向。与传统的农户散养模式相比,规模化的养殖对养殖场周边环境及生态平衡带来很大的压力。不良的养殖环境会造成奶牛乳房炎、肢蹄病等健康问题,从而影响生产效益,而且随着国家环保政策的出台,对养殖场的环保要求越来越高,这也直接关系到牛场的生存。当前养牛业面临的最大问题是怎样实现生态养殖、绿色养殖,牛粪的处理和利用成为重要的环节。棚下牛粪养殖蚯蚓技术,为养殖户提供了一个解决牛粪污染环境并提高养牛经济效益的方法。 展开更多

关键词 生态养殖 肢蹄病 绿色养殖 规模化养殖 养殖环境 养牛业 生态平衡 农户散养

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中国南方地区肉羊产业情况及展望

13

作者 熊海谦 程蕾 +7 位作者 刘文凯 余婕 包细明 向敏 胡修忠 王定发 周源 刘辰晖 《中南农业科技》 2023年第11期166-171,共6页

对2015—2021年中国南方地区肉羊产业规模、分布、品种及饲料资源等进行了分析。结果显示,四川省和云南省是中国南方地区肉羊产业的核心省份;近7年,南方肉羊产业规模稳步扩张,但仍与北方存在较大差距;产业重心呈从沿海向内陆,从长江上... 对2015—2021年中国南方地区肉羊产业规模、分布、品种及饲料资源等进行了分析。结果显示,四川省和云南省是中国南方地区肉羊产业的核心省份;近7年,南方肉羊产业规模稳步扩张,但仍与北方存在较大差距;产业重心呈从沿海向内陆,从长江上、下游向长江中游转移的趋势;外来品种难以适应当地气候,地方品种资源较为丰富但缺乏系统选育,培育品种少;常规饲料原料价格持续升高,非粮饲料资源丰富,但缺少相应的开发利用。从加强良种培育、健全饲料体系、发展智慧牧业3个角度对南方地区肉羊产业进行了展望,推进现代分子育种技术在本地新品种的培育和改良工作中的应用,搭建联合育种平台,培育适合本地的多羔、耐热和舍饲新品种;推进非粮饲料的饲料资源化应用,开发水生植物非粮饲料,缓解现环境下的饲养成本增加问题;将物联网、大数据、云计算、人工智能、区块链等技术与肉羊养殖对接,搭建智慧牧场,减少人力成本,开展肉羊精细化管理,为南方地区肉羊产业的发展提供参考。 展开更多

关键词 肉羊产业 品种培育 非粮饲料 智慧牧场 中国南方地区

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羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究 被引量：9

14

作者 李婷 包细明 +7 位作者 鲜思美 张益 饶体宇 吴伯梅 张友 刘嫒 李鹏飞 闵德省 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期924-931,共8页

为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(I... 为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与pVAX1组、PBS组相比差异极显著(P<0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P>0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P<0.01)。结果表明,pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。 展开更多

关键词 IL-2 OrfV F1L基因 核酸疫苗 免疫应答

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羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答 被引量：10

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作者 李鹏飞 冯将 +5 位作者 鲜思美 刘嫒 李婷 包细明 张益 张素辉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期704-708,715,共6页

为研究所构建羊口疮病毒（OrfV）B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果，本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增，克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒，进行酶切和测序鉴定；采用脂质体法将pVAX1-B21。真核表达质粒转染MDBK... 为研究所构建羊口疮病毒（OrfV）B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果，本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增，克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒，进行酶切和测序鉴定；采用脂质体法将pVAX1-B21。真核表达质粒转染MDBK细胞，RTPCR和IFA法检测B2L基因在MDBK细胞中的转录和表达；将构建的DNA疫苗免疫KM系小鼠，采用间接ELISA、MTT和FACS法对其诱导的免疫应答进行研究。结果显示，成功构建pVAX1-B2L真核表达质粒，并在MDBK细胞中表达；免疫小鼠后，DNA疫苗能诱导小鼠产生Orfv特异性抗体；脾淋巴细胞增殖、CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚群百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子均高于pVAX1组和PBS组。结果表明，本研究制备的DNA疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。 展开更多

关键词 羊口疮病毒(OrfV) B2L基因 DNA疫苗 体液免疫 细胞免疫

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鉴别四种鸭源肠道易感病原菌的多重PCR的建立 被引量：14

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作者 包细明 张益 +6 位作者 鲜思美 李婷 刘良林 王现科 饶体宇 吴伯梅 张友 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1542-1547,共6页

为了建立能同时快速鉴别沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的多重PCR检测方法,参考GenBank中沙门菌invA基因序列、鸭疫里默氏杆菌OmpA基因序列、巴氏杆菌KMT1T基因序列和大肠杆菌PhoA基因序列,分别设计特异性引物,用已分离、... 为了建立能同时快速鉴别沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的多重PCR检测方法,参考GenBank中沙门菌invA基因序列、鸭疫里默氏杆菌OmpA基因序列、巴氏杆菌KMT1T基因序列和大肠杆菌PhoA基因序列,分别设计特异性引物,用已分离、鉴定、保存的四种细菌DNA筛选PCR缓冲体系、扩增程序,优化退火温度与引物浓度。结果表明,设计的4对引物能分别能特异性扩增出相应的靶基因,建立的多重PCR方法特异性强、敏感性高,可用于沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌混合感染病例的快速鉴别诊断。 展开更多

关键词 沙门菌 鸭疫里默氏杆菌 巴氏杆菌 大肠杆菌 多重PCR

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山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：6

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作者 李婷 张益 +3 位作者 鲜思美 包细明 冯将 李鹏飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1292-1298,共7页

根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏... 根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L^1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。 展开更多

关键词 山羊 细胞因子 实时荧光定量RT-PCR SYBR GreenⅠ

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一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤的病理学观察 被引量：3

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作者 鲜思美 李鹏飞 +5 位作者 熊毅 冯将 刘宗胜 包细明 张益 李婷 《黑龙江畜牧兽医（下半月）》 北大核心 2017年第11期94-95,295,共3页

为了对羊地方性鼻内肿瘤的诊断和防治提供理论依据,对贵州省一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤病例进行了临床症状与病理学观察。结果表明:患病南江黄羊临床上以面部肿胀、张嘴呼吸、鼻腔流出浆液性分泌物、呼吸困难与有鼻塞音等呼吸道症状和... 为了对羊地方性鼻内肿瘤的诊断和防治提供理论依据,对贵州省一起南江黄羊地方性鼻内肿瘤病例进行了临床症状与病理学观察。结果表明:患病南江黄羊临床上以面部肿胀、张嘴呼吸、鼻腔流出浆液性分泌物、呼吸困难与有鼻塞音等呼吸道症状和进行性消瘦为特征;肿瘤起源于筛骨黏膜,呈单侧生长、菜花状、粉红色,质脆,无包膜,表面覆盖大量黏液,完全占据单侧鼻腔;组织学上,鼻内肿瘤主要表现为腺管状生长,腺管管腔内充盈大量红染均质渗出物,有腺管共壁现象,瘤细胞偶见病理性核分裂象等;未发现肿瘤向其他组织与器官转移。 展开更多

关键词 南江黄羊 地方性鼻内肿瘤 流行病学 临床症状 病理学

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羊口疮病毒F1L基因真核表达质粒构建及对小鼠的免疫原性 被引量：2

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作者 李鹏飞 冯将 +4 位作者 刘嫒 李婷 包细明 张益 鲜思美 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期326-331,共6页

构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达质粒，并探讨其对小鼠的免疫原性。本试验采用PCR扩增pMD18TFIL克隆质粒的F1L基因并将其克隆至pVAX1载体中，构建真核表达质粒并转染至MDBK细胞，采用RT—PCR和间接免疫荧光检测F1L基因在MDBK细胞中的... 构建羊口疮病毒F1L基因的真核表达质粒，并探讨其对小鼠的免疫原性。本试验采用PCR扩增pMD18TFIL克隆质粒的F1L基因并将其克隆至pVAX1载体中，构建真核表达质粒并转染至MDBK细胞，采用RT—PCR和间接免疫荧光检测F1L基因在MDBK细胞中的转录和表达。将构建的pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠，通过间接ELISA、MTT和FACS法对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果表明，成功构建了真核表达质粒pVAX1F1L，并能在MDBK细胞中获得较高水平的表达。免疫小鼠后诱导的特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖反应、CD4^＋、CD8^＋细胞百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于pVAX1纽和PBS对照组。因此，制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 FIL基因 核酸疫苗 免疫原性 小鼠

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贵州黑山羊、黔北麻羊IL-2基因的克隆与生物信息学分析

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作者 鲜思美 李鹏飞 +4 位作者 刘嫒 李婷 包细明 张益 冯将 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期3287-3295,共9页

为获得贵州特色品种黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,本试验以Con A刺激的贵州黑山羊与黔北麻羊外周血淋巴细胞为材料,采用RT-PCR方法分别扩增贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,进行克隆与生物信息学分析。结果显示,（1）贵州黑山羊与黔北麻羊IL-... 为获得贵州特色品种黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,本试验以Con A刺激的贵州黑山羊与黔北麻羊外周血淋巴细胞为材料,采用RT-PCR方法分别扩增贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因,进行克隆与生物信息学分析。结果显示,（1）贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因核苷酸与氨基酸一致性为100%,完整编码阅读框大小为468 bp,编码155个氨基酸;（2）黔北麻羊、贵州黑山羊IL-2基因与Gen Bank中羊源IL-2基因核苷酸一致性为95.9%~100%,氨基酸一致性为91.1%~100%;（3）遗传进化树结果表明,贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因处于同一进化分支,与羊源IL-2基因亲缘关系较近;（4）生物信息学分析结果显示,IL-2蛋白二级结构中以α螺旋与无规则卷曲较多,该蛋白为亲水性蛋白,含信号肽序列,无跨膜结构,无特征功能结构域;（5）不同动物IL-2蛋白的抗原性分析存在差异,贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2蛋白与羊源IL-2蛋白的比较差异较小,与人和其它动物的比较差异较大。由此得出结论,获得贵州黑山羊与黔北麻羊IL-2基因完整编码区序列,二者核苷酸与氨基酸序列一致。贵州黑山羊/黔北麻羊IL-2基因与羊源IL-2基因亲缘关系近,预测其编码的蛋白为亲水性的分泌型蛋白,不同动物IL-2基因抗原性存在差异。 展开更多

关键词 贵州黑山羊 黔北麻羊 IL-2基因 克隆与分析

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