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SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法
1
作者 何龙才 宋文学 +5 位作者 明江 陈光唐 王军浩 廖益东 崔君拴 徐卡娅 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第7期1395-1400,共6页
背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质... 背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。 展开更多
关键词 原代皮质神经元 小胶质细胞 SD大鼠 细胞提取 细胞培养
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颅内移植人骨髓间充质干细胞减轻大鼠脑缺血再灌注损伤
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作者 宋文学 廖益东 +7 位作者 明江 何龙才 陈光唐 陈晨 王梓力 熊明松 崔君拴 徐卡娅 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2024年第31期5036-5041,共6页
背景:研究发现激活Nrf2/HO-1通路可减轻脑缺血再灌注损伤引起的氧化应激,但人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC)是否可激活Nrf2/HO-1通路减轻脑缺血再灌注损伤目前尚缺乏相关研究。目的:探讨颅内移植hB... 背景:研究发现激活Nrf2/HO-1通路可减轻脑缺血再灌注损伤引起的氧化应激,但人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC)是否可激活Nrf2/HO-1通路减轻脑缺血再灌注损伤目前尚缺乏相关研究。目的:探讨颅内移植hBMSC是否通过激活Nrf2/HO-1途径减轻脑缺血再灌注模型大鼠的氧化应激损伤。方法:40只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、hBMSC移植组、hBMSC+溶剂组和hBMSC+Nrf2抑制剂组,每组8只。模型组、hBMSC移植组通过线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,1 h后取出线栓,将30μL PBS或培养至5代以后的hBMSC注入大鼠右侧皮质及纹状体内;hBMSC+Nrf2抑制剂组和hBMSC+溶剂组在造模前24 h于左侧脑室分别注射Nrf2抑制剂Brusatol或其溶剂二甲基亚砜,然后制备大脑中动脉栓塞模型,注射hBMSC。移植后3 d进行相关指标检测。结果与结论:①脑CT和TTC染色显示脑梗死灶面积和体积一致:模型组>hBMSC+Nrf2抑制剂组>hBMSC+溶剂组>hBMSC移植组>假手术组;②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示,假手术组缺血侧脑组织形态完好和神经元正常;模型组神经元排列结构紊乱和神经元损害严重;与模型组相比,hBMSC移植组、hBMSC+溶剂组病理形态和神经元损伤有较大的改善;与hBMSC+溶剂组相比,hBMSC+Nrf2抑制剂组病理形态和神经元损伤更严重;③Western blot和氧化应激指标检测结果显示,与假手术组相比,模型组Nrf2和HO-1蛋白表达降低(均P<0.05),丙二醛升高而超氧化物歧化酶降低(均P<0.05);与模型组相比,hBMSC移植组和hBMSC+溶剂组Nrf2、HO-1蛋白表达升高(均P<0.05),丙二醛降低而超氧化物歧化酶升高(均P<0.05);与hBMSC+溶剂组相比,hBMSC+Nrf2抑制剂组Nrf2和HO-1蛋白表达降低(均P<0.05),丙二醛升高而超氧化物歧化酶降低(均P<0.05);④上述结果表明,hBMSC可能通过激活Nrf2/HO-1途径减轻脑缺血再灌注氧化应激损伤。 展开更多
关键词 人骨髓间充质干细胞 脑缺血再灌注损伤 氧化应激 核因子E2相关因子2 血红素加氧化酶1
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